细胞凋亡检测方法汇总

 

细胞凋亡，以前也称细胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理条件下，细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象，胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。检测细胞凋亡的方法很多，如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。

细胞凋亡可分为早期凋亡（细胞膜结构发生变化，磷酯酰丝氨酸外翻）、早中期凋亡（细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素c、到胞浆）、中晚期凋亡（细胞凋亡的信号转导）、晚期凋亡（DNA降解为180-200bp片断）。


细胞凋亡的死亡受体途径及调控：死亡因子受体(Fas)/死亡因子Fas配体( FasL)死亡通路 ；TNFR 死亡通路。
线粒体途径及调控。内质网通路：CHOP通路；JNK 通路；Caspases 12通路。端粒酶途径的细胞凋亡。NO参与的细胞凋亡反应。
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一、基于形态学的方法
1.1 电子显微镜检查
“凋亡”最早是一个细胞形态学概念。因此，鉴定凋亡的金指标，往往是基于形态学的。
凋亡和另外一种主要的细胞死亡类型“坏死”（Necrosis）有着显著的亚细胞形态差异。简而言之，在透射电镜下，凋亡细胞染色质浓聚，通常沿核膜分布；整体细胞形态发生变化，如细胞表面微绒毛状突起消失，细胞间接触消失，细胞质浓聚，形成具有膜结构的包裹着胞浆内容物和核物质的凋亡小体；相比坏死，凋亡细胞的核结构直到晚期才会解体。

1.2 细胞核形态染色
既然凋亡细胞其中一个形态学特征是染色质浓聚，且细胞核结构在凋亡后期崩解，那么观察核形态也是较为直接的指标。相比其他形态学指标来说，观察细胞核形态不需要电子显微镜，而只需用荧光染料配合普通的荧光显微镜即可。典型实验结果如下图：

一般而言，核形态染色采用的是DAPI和Hoechst系列荧光染料。因为这些染料特异性强，荧光性能好。其中，Hoechst 33342是最为方便的染料。它可自由穿透细胞膜，直接对核染色，而不需要固定、破膜步骤。因此，Hoechst 33342还能结合形态学的相差图像，以及其他活细胞染料（如用7-AAD等染细胞膜破裂的细胞），同时对多个指标进行定量。
二、基于细胞功能的方法
2.1 线粒体膜电位检测
不少凋亡过程，都会涉及线粒体功能的失调，包括线粒体膜电位差（Δψ）的降低甚至丢失。JC-1是亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色荧光强，细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。

2.2 细胞膜表面磷脂酰丝氨酸检测
正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位千细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化， PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位千细胞膜的内表面，无法与Annexin V特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexin V鉴别凋亡细胞和活细胞。坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS, 所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整， PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

三、基于生化标记的方法
3.1 凋亡分子标记检测
细胞凋亡途径，是由一套明确的信号通路层层调控的。在绝大多数情况下，所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的最终执行者Caspase-3之上。上游的凋亡信号通过切割Caspase-3，使其具备酶活，并执行最后的凋亡程序。Caspase-3 正常以酶原（32 KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3 的活性明显下降。活化的Caspase-3由其前体裂解的一个17KD亚单位和一个12KD亚单位组成，形成异二聚体，可被Anti-Active Caspase-3抗体特异性识别。用荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体即可检测到活化的Caspase-3。Caspase分子的检测其主要原理可以分为两大类：检测Caspase剪切体的含量，以及检测Caspase的活性。

3.2 DNA损伤检测
在细胞凋亡的后期，Caspase会激活Caspase-Activated DNase（CAD），切割核小体之间的DNA，形成以180-200 bp为单位的DNA片段，经琼脂糖电泳后形成DNA ladder。
围绕DNA断裂的检测方法还有脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），即Tunel检测法。细胞凋亡时DNA双链或单链断裂会产生大量的粘性3’-OH末端。以此为线索，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）协助下，将生物素/荧光素标记的dUTP绑定在3’-OH末端，并通过酶联显色或荧光检测来定量分析结果。

细胞凋亡就是凋亡通路中的各种分子促成的，不能因为检测单一指标就轻易断定凋亡的发生。毕竟，细胞凋亡事件中，每个指证只维持一段时间，因而各位小伙伴们应该广撒网、多捞鱼，最好能在不同时间段进行多指标的同时检测，这才能确定凋亡的发生。最后为了不造成假阳性和假阴性，阳性和阴性对照也是必不可少的，以保证检测结果的准确性。