蛋白质组学前处理方法大揭秘！学会了这几招之后“包治百病”

编者按：

 

在蛋白质组学研究中，除质谱仪硬件的灵敏度和高分辨率影响因素外，样品前处理、质谱数据采集和数据分析均对蛋白组学研究有影响。样品前处理过程复杂，且需要根据具体的实验目的进行优化，目的是减少在样品处理阶段对蛋白造成的降解和修饰，释放尽可能多的肽段，用于最终质谱的检测。

 

本期为降低科研工作者在前处理阶段的工作量，小鹿整理了在蛋白组实验中，最关键的一步——蛋白质提取的几种不同类型样本的前处理方法。只有对症下药，才能保证拥有完美的实验结果。接下来就让我们开始从动物组织样本的处理开始了解吧！

 

动物组织蛋白抽提

 

如果拿到一个动物组织样本，我们首先要做的就是对其进行充分的研磨，有条件的实验室也可以使用匀浆机，只要能够将其均质化，我们的目的就达成啦。

但是将组织进行研磨是不能让蛋白充分得到释放的，还需要将细胞全部破碎。为此，我们需要的还有超声破碎仪这个设备。
 

有了超声破碎仪的辅助，细胞中的蛋白质可以充分的释放，进而提取到充足的全蛋白。

植物组织蛋白抽提

 

植物蛋白抽提的难度会比动物蛋白抽提更高一些，因为其细胞壁杂质、叶绿素等成分都会干扰后续实验的效果，所以我们建议采用酚抽提法，可以去除多余杂质的干扰。

 

研磨好植物样本之后，加入酚抽提液至离心管的1/2，常温下等待10分钟反应，再加入Tris平衡酚至离心管口，放入4℃冰箱中萃取30分钟。30分钟后，酚层与水层会进行分离，上层酚层就是我们萃取得到的蛋白质，吸取出来后使用有机试剂进行沉淀以达到去除酚的目的，得到纯化蛋白溶液。
 

图 | 加完Tris平衡酚反应之后离心得到的分层现象。

微生物蛋白抽提
 

微生物由于其细胞壁结构特殊，提取需要采用酚抽提法，可以去除多余的杂质。超声破碎之后，操作与植物的酚抽提法基本一致。加入Tris平衡酚，反应后，离心取上层。取样品粉末补充（预冷）抽提液至1ml混匀，再进行超声破碎。加入有机试剂洗去酚体系，沉淀蛋白。将沉淀的蛋白收集并且复溶离心取上清获得总蛋白溶液。

 

对于微生物蛋白的抽提，总结起来就是要同时用到植物和动物的提取方法，是不是更加便于理解了~

 

特殊样本处理

 

蛋白组学研究中也有很多特殊的情况，这里给大家分享其中几点。

1.血清血浆：血清/血浆在做蛋白质组学前，如无特殊实验目的需要去除高丰度蛋白。一般使用特异性结合高丰度蛋白的抗体柱子对其进行去除。

2.尿液/发酵液：这类蛋白浓度较低但容积大的样本可以使用超滤管，进行超滤浓缩，将小分子全部过滤，保留蛋白质，起到提高浓度的效果。

3.做蛋白质修饰组学的样品：需要添加相应修饰的酶抑制剂，保证相应修饰的蛋白质不会降解。

 

最后，需要给小伙伴们强调一个重点：蛋白质遇冷再遇热（反复冻融）会导致蛋白质降解，就很有可能丢失很多重要的蛋白质导致研究出现问题。所以为保证样本不变质，必须要在一个恒定、低温的环境内进行实验。所以，液氮或者干冰是做实验的前提，小伙伴们一定要记得备好哦！

 

今天的分享就到这里，祝愿小伙伴们在科研的道路上一帆风顺，取得优秀的成果！

 

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文章来源于鹿明生物