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如何搞定原代细胞的基因敲除?原代细胞是新鲜从动物或者人体组织分离的第一代细胞,细胞的代谢和基因控制通路基本和体内的细胞一致,所以一直是细胞研究方面最适合的细胞模型,特别是做基因敲除和基因编辑等更是优势突出,但是也是难点! 原代细胞具体的难点包括: 1、传代次数有限; 2、细胞的转染困难; 3、细胞不能形成克隆; 具体采取的策略包括: 第一、细胞永生化技术流程:分离获得原代细胞之后进行基因转染或者病毒诱导 正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长,但经过有限次数的传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡,这种现象称之为海弗利克极限。有的细胞自发或受外界因素的影响,可以从增殖衰老危机中逃离,从而拥有无限增殖的能力,该过程称之为细胞永生化。然而自发永生化的几率非常小,啮齿类动物为10-5-10-6, 而人类细胞则更为罕见, 小于10-12。通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变,可以增加永生化的发生率,从而建立稳定的永生化细胞株。 方法: 1、hTERT端粒酶的方式,一般可以保留最佳的细胞基本代谢情况,同时不影响细胞的其他的基因功能; 2、病毒诱导法:EB、HPV、SV40等病毒或者病毒基因诱导细胞永生化; 3、原癌基因诱导法:如Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc和Mdm2,通过基因转染可介导目的细胞永生化; 第二、对永生化的细胞进行细胞研究 1、细胞克隆分析; 2、细胞倍增时间分析; 3、细胞的传代分析; 第三、对永生化细胞进行基因研究 1、设计敲除策略; 2、合成或者构建gRNA 3、转染到目标细胞进行基因编辑工作; 如果不希望通过永生化的流程,就需要考虑MixClone的技术流程了: 1、分离获得原代细胞,经过至少一次的传代; 2、构建gRNA载体或是病毒,对目的细胞进行转染; 3、加入药物对没有被转染的细胞进行筛选; 4、传代扩增目的细胞是MixClone的状态; 5、对MixClone(Cell Pool)进行基因和生物学表型的分析。 也欢迎大家尝试我们的Cas9X™平台的ClonePlus™技术服务:400-990-0791咨询 或者关注“Cas9x细胞基因敲除”公众号了解。 |