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悬浮细胞基因敲除流程大致分如下: 1、悬浮细胞选择: 增殖快,容易形成克隆,细胞无多倍体现象,细胞不会出现分化,培养基简单,没有支原体污染; 2、悬浮细胞检测: 1)细胞倍增时间检测 2)细胞的安全检测 3)细胞的基因拷贝数查询 4)细胞的转染效率测试 3、细胞基因敲除策略: 1)可以使用片段敲除的策略 2)细胞敲除的基因对细胞增殖没有影响(如果有影响一定要使用单克隆扩增) 4、敲除细胞单克隆: 1)极限稀释法,通过不断的稀释使得每个孔只有一个细胞; 2)由于悬细胞的悬浮增殖,很难判断每个液体层都没有细胞; 5、基因敲除功能验证: 1)先要对细胞做PCR检测,保证片段敲除; 2)Q-PCR检测看看在mRNA水平的敲除效果; 3)做WB看看蛋白的效果和生物表型的影响。 |