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引物设计

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问设计好的引物如何在NCBI 上比对?

goleo

引物比对在ncbi主页www.ncbi.nlm.nih.gov/上点blast，然后选择左上角那个版块里的search for short，nearly exact matches，输入上游引物序列，在下一行输入下游引物序列，选择你要看的种属（没有特殊要求就选择nr），点submit，在下一个窗口中点format，就可以了。这样是看一对引物的特异性。

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问引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

zcldf001

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o

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