PCR 实验 protocol 汇总

PCR 产物可通过硅胶柱纯化回收，硅胶膜在高盐度缓冲液中可以结合 DNA，低盐度缓冲液或水可洗脱 DNA（硅胶膜表面的硅胶醇基团呈弱酸性，水化后带负电荷。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，形成的阳离子电子桥能够中和 DNA 和硅烷醇基团之间的表面负电荷，从而使 DNA 牢固的吸附在硅胶膜表面。相反，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅烷醇基团与 DNA 磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放 DNA）

传统的多重 PCR（Multiplex polymerase chain reaction，MPCR）是在普通 PCR 的基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段，结合一定的检测手段进而实现同时对多个靶标进行诊断的技术。因在同一体系里加入多对引物合成多对扩增子，易发生引物间及扩增子间的串扰，故需要对体系进行优化，否则会造成

cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于逆转录 PCR从低丰度的转录本中快速扩增 cDNA 的 5' 和 3’ 末端的有效方法。cDNA 3’ 端通常含有调控 mRNA 稳定性或亚细胞定位的信号，5‘ 端非翻译区编码含有mRNA 稳定性、亚细胞定位或翻译效率相关的结构信息，而在某些情况下 cDNA 末端序列可能缺失，而 R

限制性片段长度多态性 PCR（PCR-RFLP），首先利用 PCR 扩增目的基因，然后用限制性内切酶酶解样品 DNA，产生大量的限制性酶切片段，通过凝胶电泳分离不同大小的片段，可直接紫外观察，也可与克隆 DNA 探针进行 southern 杂交和放射显影。DNA 限制性内切酶具有识别特定的 DNA 序列并在特定的部位切断 DNA 双链的活性功能，目标 DNA 分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失

OVERLAP PCR，也称重叠延伸 PCR，是指先将两个想要连在一起的序列记为 A、B，用一对具有互补末端（在原基因上选取使得引物 A2 的 5' 端引物与 B1 的 3' 段引物之间有 20 bp 左右的互补片段）的相反方向引物将原来序列上 P 出重叠互补的片段，再用原来的正常引物扩增具有互补片段的序列，从而使得这两个并不在一起的序列在退火时可以互补配对连接在一起。

降落 PCR 是 Dn 于 1991 年最早发明的指每一个(或 n 个)循环降低 1(或 nC)退火温度，直至达到一个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行 10 个左右的循环。据统计，正确和非正确退火温度之间的 1 差异将造成 FR 产物量的 4 倍差异，如果相差 5 就会产生 42(1024)倍的优势,因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。退火

标准 PCR 用来扩增位于两条引物内侧的 DNA 片段，与此相反，反向 PCR 技术（也被称为倒置或者向外 PCR）是用于扩增一段已知 DNA 序列旁侧的 DNA 序列，这些序列中没有可以用于扩增的引物。在快速高效的 DNA 测序出现之前，这项技术在几个独立课题组内都得到很好的发展前，在多数情况下，测序已成为确定未知 DNA 片段的主要选择手段。然而，反向 PCR 仍旧被广泛应用于快速的等位基因分

原位 PCR 利用了成熟发达的 PCR 或 RT-PCR 技术，使目的基因可以在固定组织或细胞的原位扩增；从而保证在亚细胞结构不被改变或破坏的情况下，允许目的基因在细胞的不同亚室中扩增并被检测到。根据目标核酸的不同，原位 PCR 可分为以 DNA 为目标的原位 PCR 和以 RNA 为目标的原位RT-PCR，两种均需要先将组织或细胞样品固定后使用蛋白酶对细胞进行通透处理，再进行核酸扩增过程。根据扩

原位 PCR 利用了成熟发达的 PCR 或 RT-PCR 技术，使目的基因可以在固定组织或细胞的原位扩增；从而保证在亚细胞结构不被改变或破坏的情况下，允许目的基因在细胞的不同亚室中扩增并被检测到。根据目标核酸的不同，原位 PCR 可分为以 DNA 为目标的原位 PCR 和以 RNA 为目标的原位RT-PCR，两种均需要先将组织或细胞样品固定后使用蛋白酶对细胞进行通透处理，再进行核酸扩增过程；根据扩

以 mRNA 为模板，在反转录酶的催化下形成的互补DNA（complementary DNA）即为 cDNA，由于 cDNA 不像基因组DNA 那样有内含子，可以在原核生物中表达，基因蛋白编码序列的扩增、重组载体构建等常以 cDNA 为模板进行聚合酶链式反应。

聚合酶链式反应热变性温度下成熟质粒可以解螺旋、解聚，暴露的单链核苷酸序列可以作为模板，在特异引物、脱氧核糖核酸酶、DNA 聚合酶等存在的情况下扩增出大量目的序列。

聚合酶链反应中循环开始前的预变性和 PCR 循环过程中的变性是在 94 ℃ 或 95 ℃ 的高温下进行的，该温度可使模板 DNA 变性、双链解开，实验发现该温度也可破坏大肠杆菌菌膜，暴露感受态细胞中的 DNA 或质粒，直接挑取琼脂糖凝胶平板上的单克隆菌落可以直接用于充当 PCR 反应的模板。

一、总 RNA 的提取见总 RNA 的提取相关内容。二、cDNA 第一链的合成目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。1.在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-