流式细胞术

流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。

一、组织培养细胞的染色 1. 通过对悬浮培养中的细胞倾析或对单层培养的细胞蛋白酶消化来收获细胞。计数细胞，800 g 慢速离心 3 分钟沉淀细胞。 2. 细胞染色。 3. 在 NST-DAPI 缓冲液中于冰上孵育细胞 15 分钟。 4. 用 35 μm 孔径的尼龙筛目过滤细胞。 5. 用流式细胞计量术分析染色细胞。 二、固体组织的染色 1. 如冷冻，将组织片放入装有补充 5% 小牛血

1. 分离细胞并移至 15 ml 的锥形管中。检查有单个细胞悬浮，1000 g 离心 5 分钟，弃上清。 2. 用不含 Ca 或 Mg 的 PBS 将细胞洗 2 次，计数细胞总数，记在管山。 3. 用约 500 μl 的 PBS 重悬细胞。 4. 加 5 ml 冷乙醇，4℃ 固定过夜。 5. 取 5X106 细胞放入 15 ml 锥形管中，1000 g 离心，弃乙醇。 6. 悬搅沉淀，用

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

细胞因子流式细胞术（Cytokineflowcytometry，CFC）是指应用抗细胞因子抗体来分析作为细胞活化标志细胞因子的流式细胞术的统称。此技术最常见的应用是对经体外短时间活化并固定和通透的细胞进行细胞内细胞因子的标记。当用特异抗原刺激时，此技术可以对稀有的抗原特异的 T 细胞进行定量分析。

流式细胞术目前主要用于检测样本中所发出的荧光强度，分析细胞表面和细胞内分子表达水平，从多样性的细胞群中分辨及界定不同细胞种类，测定分离出的细胞亚群纯度，以及分析细胞的大小和总量。它可以同时分析单个细胞的多个参数。