实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问请教几个问题，大鼠在颈总动脉给药后，拔出针头后必须结扎该颈总动脉吗？这之后能够存活吗？

ahan

如果是直接在大鼠体表进针，需消毒好进针部位，进针后可以直接按压，按压时间5-15分钟，自己摸索。如果是大鼠劲总动脉暴露后给药，可能需另当别论。个人之见，仅供参考

1 回答1330 围观

问关于 PHA 刺激 PBMC 增殖，用 CCK-8 检测，实验孔 OD 值却不稳定是为什么？

roby_0_0_2000

你的PHA-p 5ug/ml就可以了，浓度大了自然会死。死于过度刺激。还要加IL-2，不加会死的。

3 回答4021 围观

问蛋白质免疫印迹一1抗2抗用什么稀释更好？

蜻蜓美女

1，我们实验室是用牛奶加TTBS稀释的，但是磷酸化的抗体一般是BSA加TTBS，效果很好。2，我们实验室是用水。希望对你有帮助

11 回答7945 围观

问WB转膜曝光后少样本是为什么？

phhcrab

你是用传统胶片曝光的还是化学发光成像？每次都出不来的是同一个泳道的吗？如果每次都是固定的位置出不来，是不是可以检查一下实验硬件？

4 回答2489 围观

问免疫组化结果与文献相反是为什么？

yqc127

这可能要从两方面考虑：1. 自己的主观原因，可能是自己实验操作的问题；如果自己的问题感觉不大，也可能是抗体特异性的问题，可以看看有没有相关的文献也用了类似的抗体，进而一步步查找问题。2.标本的客观问题，由于不知道有没有可能你的标本是一个有别于文献报道的特例？还是文献报道的情况是有限制范围的？这要自己斟酌。即使是同一样本，由于存在取材，保存，处理等多方面的差异也可能导致最终的结果的不同。

3 回答3492 围观

问WB 没有看到条带是什么原因？

Neuron_Glia

若抗体中有防腐剂，如叠氮钠，会使荧光猝灭；另外，荧光越强，淬灭越快。但是你看不到条带，最可能的原因还是抗体效价较低或浓度不足。

3 回答1877 围观

问我最近做western的内参条带特别好，背景也很干净，但是目标蛋白要么没有条带，要么有条带但是背景很脏，为啥呢？

我是金博士

1、内参与目的蛋白用的是相同的二抗吗？2、洗膜3min，5-6次3、背景高，调整二抗浓度4、时有时无，请在转膜后用丽春红染膜

1 回答4257 围观

问阳性克隆检测PCR问题

过客一名

要不用M13引物或你的引物A或D去测个序，看看究竟连接的片段是什么？

2 回答1125 围观

问目的带做出来了，但是为什么膜的内参一直都没跑出来？

我是金博士

1、样品中无内参蛋白表达。 2、内参不能识别你检测的种属的样品？

1 回答2007 围观

问请问客养的小分子量蛋白的转膜条件 OK 吗？

xuxian1225

完全可以，我做的蛋白就是11k的，100V转120分钟都没问题，90分钟对这么小的蛋白足够了。

1 回答3435 围观

问Native Page 为什么样品的下段都不见蛋白条带？

我是金博士

你的胶做得不太好啊，marker都分不开。你要是想知道条带少，是上样量少了还是降解了，可以做个上样量梯度，一般都会做个预实验，看看浓度。

1 回答2362 围观

问蛋白提取总是出现问题？

我是金博士

1、50-100ul，看细胞沉淀的多少而定2、细胞太少了？细胞中DNA含量比较大，如果有条件，用超声处理一下就好了

1 回答1684 围观

问关于用 cre 小鼠和 loxp 小鼠获得条件敲除小鼠的问题

tntztyx

cre 采用的是calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIalpha promoter ，启动活性就由CAMKII的启动子决定，与基因组中camkII的启动活性类似，当然有表达特异性可能有变化，毕竟是模式改变的转基因动物

1 回答8762 围观

问WB 结果的内参非常好，既没有背景条带也亮，而目的就不行，不是没有条带就是背景很高，这又是什么原因呀？

我是金博士

1、任何一个公司的抗体都不是百分之一百的。我认为CST的抗体成功率是目前最高的2、表达量的多少可以看看文献3、CST说明书用的是什么细胞作为抗原呢？如果你手上有可以做个验证。看是否你做的细胞表达少

1 回答2213 围观

问新手求解答

我是金博士

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。

1 回答639 围观

问假如模板DNA中混有杂蛋白是不是就扩增不出来

我是金博士

你的DNA模版是怎么提取的呢？有没有进行过处理？扩增没成功，有很原因，杂蛋白的影响也要看情况，一般试剂盒都能去掉的。

1 回答1726 围观

问WB一抗二抗配好后4℃保存能多久？一个月怎么样？

我是金博士

1、一抗4度可以在一周左右，加一点NaN3二抗现用现配！且不可加NaN3丽春红不会影响，染完直接封闭，封闭后丽春红就没了。2、一抗是什么？二抗还需要孵育过夜？3、先把内参做好

1 回答17571 围观

问PCR最低反应体系

我是金博士

你为啥要5μl体系呢？理论是引物和模版按比例啊，这样不太好操作呀，不符合常规呢。

1 回答1565 围观

问如何确定普通反转录 PCR 时 cDNA 的用量？

苏格兰白草莓

必须要保证cDNA的量要一致才有可比性，所以最好还是做RT-qPCR。之所以要做内参，一是利用△△C法运算得到基因差异，二就是利用内参可看得出你每孔的cDNA模板量是否具有一致性，一般来说，我们实验要求样品内参的Ct值最好相差不要超过0.2~0.5，还有值得注意的是，如果内参Ct值出现过大或者过小都会影响到你的实验数据分析，一般来说内参在Ct值=12~15的位置左右为宜

4 回答2369 围观

问我用的预染marker，转膜时发现完全没有转到膜上，但是胶上也没有marker，这是什么原因呢？

我是金博士

1、这个正常，转膜结果到底如何需要染膜来看膜上的蛋白 2、不能这样来确定 3、这个很奇怪，没碰到，看看你做的三明治是否成功，仪器是否有问题 4、与电压之类是有关系，但是不应该2个泳道的marker，一好一坏

1 回答6239 围观

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