实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问请问 PCR 程序最后给出的 RQ 值是否可以直接用来统计？

qianliu185676911

PCR反应中,CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；RQ值是比较的Ct值。它经过数学公式变形而来。它是判定实验样品中目标靶位点与在标准样品中相同靶位点的表达变化情况。

1 回答5631 围观

问请问性价比较高的蛋白裂解液推荐什么品牌？

萧莣苼

蛋白裂解液，现在差异不会太大，进口有CST，abcam等等，国产有碧云天，生工，百奇生物等等，不同蛋白裂解液可能不一样。

1 回答890 围观

问石蜡切片免疫组化实验做不出结果是为什么？

苹果嘿嘿

最好把试剂和实验流程都列出来只这样说太笼统了

6 回答3003 围观

问目的基因mRNA表达量一定会比GAPDH低吗？

tntztyx

可以在NCBI看一下spc的基因表达特异性

2 回答2885 围观

问乙肝病毒的纯度 OD260/280 比值高是为什么？

alaling

如果不放心，比较好的办法是可以用RNA酶处理下。

3 回答1924 围观

问为什么本应该是核阳却结果都是浆阳？

alaling

1. 请病理科大夫确认是否为假阳性。这个是非常关键的一步2. 如果确认为真阳性，那么请确认你的抗体是正确的抗体3. 如果上面两步没有问题，请相信自己的结果！可能别人的做法是做的其它组织的或正常肺组织而不是肺癌，不同组织表达位置不同；也有可能实际情况确实如此，再找原因进行分析！不要试图改变正确的结果附会其它人的结果，这样往往会导致真相被掩盖！

3 回答1856 围观

问请问， 200kD的蛋白的转膜条件是什么？

小太爷1988

100V 2小时足够了，转膜液70%水，20%甲醇，10%10x转膜液（电转液），至于恒压与恒流哪个好，因人而异吧，各有各的喜好，恒流产热比较少，我习惯恒压转，但是因为电流会随着转膜时间的增长会加大，所以产热会多一些，不过一般没什么问题，把转膜的盒子包在冰里就好，或者有条件觉得话，放在冷室里就行，一般问题不大；如果你想恒流的话250mA2.5小时-3小时应该就可以了。至于小分子的，看你的目的蛋白有

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问关于WB的sample buffer大家看下我的是不是有问题？

小婶客de舅叔

是不是少了点dtt

2 回答3036 围观

问常用的蛋白纯化技术有什么？怎么在大肠杆菌、细胞中进行表达？

我是金博士

根据你想要表达的蛋白，查找基因，构建到原核载体上，在大肠杆菌中表达，然后进行纯化。

1 回答2109 围观

问原核表达在包涵体里，该这么提蛋白做纯化呢？

丕龙兄

1.蛋白在包涵体里很常见，原因也很多，你可以尝试一下其他的解决方案。比如说降低诱导温度，更换表达载体（GST标签有增溶作用，pCOLD低温表达载体…），更换表达菌株；2.如果上述尝试还是不成功，那就只能变性纯化了，用变性剂（如6-8M尿素）溶解包含体，然后过镍柱，这样可以得到大量蛋白，纯化出的蛋白通过透析进行复性，然后测酶活。3.复性的蛋白酶活跟所用的复性缓冲液有很大关系，查文章，用他们的实验方法

1 回答3342 围观

问血液标本怎么保存？

toadlong

一般看你干什么，一般如果用血液的DNA或者使RNA，最好直接提完之后-80保存，其他情况也直接-80保存，避免反复冻融

1 回答1578 围观

问WB 实验中如何运用凝胶成像系统照相？加完二抗用 TBST 洗之后该做什么准备？

a5055778

洗完膜加上显色体系后，放在塑料薄膜里，轻轻推去气泡，然后直接放到照相系统里照相就可以了，系统会让你选多久曝光一次和照几张相，我一般选1min-5min/5-10张；假如你选1min一次，共照5次，那么总共就是5min，选一张最好的。复制下来再用CS analyzer之类的反色输出图片就行了。

1 回答2083 围观

问常用的试剂中，哪些是有毒性的，分别有什么样的毒性？

我是金博士

基本没啥毒性，酚、氯仿是有毒的，不过很多实验室已经淘汰，另外DNAGreen，也是有毒的。其他的都还好吧。

1 回答1452 围观

问PCR产物用来跑电泳跑不出条带

我是金博士

要么胶有问题，可以同时做个参照，要么PCR不稳定，也很正常的，P不出来就要重新设计引物了哦

1 回答1657 围观

问求新购买的昆虫细胞sf9详细的复苏方法

我是金博士

下面是我复苏细胞的一些经验，不知可否对你有所帮助。1、在复苏细胞前，调好水浴锅温度至37度，并保持恒温，检查离心机的转速（900rpm）与时间（4min）。2、在超净台中，准备好无菌离心管、吸管及培养基等必需的无菌用品。快速移到37度恒温水浴锅中，并同时摇动冻存管，以加速溶解（注意：此步中，冻存物溶解所用的时间越短越好，但是水浴锅温度一定恒定为37度）。4、待冻存物溶解后，将其转移至10ml无菌离

1 回答3777 围观

问连接后切不开

我是金博士

之前能切开吗？在你构建之前，要对载体进行双酶切处理的，那个时候如果能切开，后来也是可以切开的。实在切不开可以尝试分布酶切，或者检查下酶切条件、限制性内切酶是否失效。

1 回答1181 围观

问PCR各反应体系中模版DNA和引物的量分别是多少？如何确定的？

我是金博士

1、不建议你配好再分装，都不这么操作的，你可以做20ul体系的。2、模版和引物都是有浓度要求的，然后根据浓度、体系进行计算的，具体请查看本实验，或者看分子克隆那本书，有明确写的。

1 回答7143 围观

问分泌蛋白量比较少且培养基中盐离子很多的情况下，如何能快速达到除盐和浓缩的目的？

xzw113

可以在血清饥饿后加入叠氮钠0.1%，防止蛋白降解，也可用cooktail，这个比较贵呵呵。然后用蛋白浓缩管富集milipore 有买的买10kd富集的就可以

1 回答4666 围观

问3'RACE 的时候对 oligo（dT）长度有没有什么要求？

yong8hu

不能太短，否则杂带很多，我们常设计27-29bp,设计2-3条，退火>65度。用的试剂盒对成功与否很关键，你的mRNA也是主要因素，保证没有降解。还要考虑基因表达丰度的问题。

1 回答1413 围观

问为什么一定要加內参？有的样品里如尿液中蛋白分析无合适內参怎么办？

alaling

加入内参是为了消除外部操作产生的差异。比如你需要加样1ul，你能保证枪加入的就一定准确的是1ul吗？枪尖随便挂个0.1ul和不挂，差别就有10%。尿液里的蛋白如果没有合适的内参，可以考虑以添加外参的方式进行，就是在每个样品里面添加已知量的某种纯蛋白。当然，如果用纯体积或纯样品量进行参比也是可以的。最重要的是要参考文献，看看大部分人是如何处理这种问题的。

1 回答1532 围观

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