实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问阳性位点的点突变突变蛋白不表达

hlj锦衣卫

我有一个蛋白也是，突变后表达量极速下滑。猜想可能是突变体水溶性改变或者折叠异常导致被内在蛋白质控机制给降解了。

1 回答479 围观

问样品寄送过程,哪些需要低温?哪些需要干冰?哪些常温就可以?

百泰派克-李工

样品寄送的温度要求主要取决于样品的性质。下面是一些常见的样品类型及其相应的温度要求：1.生物样品（如血液、细胞、组织）：这些样品通常需要在低温下运输，以防止细胞活性的丧失或分解。它们通常需要干冰或者液氮来保持低温。2.化学试剂：某些化学试剂在常温下可能会分解或反应，因此需要低温保存。根据试剂的具体性质，可能需要干冰或冷藏。3.药品和疫苗：许多药品和疫苗对温度敏感，需要在冷藏（2-8°C）或冷冻条件

1 回答1038 围观

问WB配上样体系怎么配呀

百泰派克-李工

Western Blot（WB）实验中的上样体系（Loading Buffer 或 Sample Buffer）通常包含几个关键成分：制备和使用方法：将以上成分按比例混合。可以根据需要调整总体积。通常将上样体系与样品按一定比例混合（例如1:1或1:3），然后在沸水浴中加热5-10分钟进行变性。加热后让样品在室温冷却片刻，然后加载到SDS-PAGE凝胶槽中进行电泳。

1 回答438 围观

问wb在转膜过程中电压如果过低会导致什么结果

百泰派克-李工

1.转移效率低下：电压是推动膜材料从一个表面转移到另一个表面的驱动力。如果电压太低，可能不足以有效地完成这个过程，导致转移效率降低。2.不均匀的转移：由于电压不足，膜材料可能无法均匀地转移，这可能导致转移后的膜出现厚薄不一、缺陷或瑕疵等问题。3.膜质量差：膜的完整性和均匀性对于其性能至关重要。电压过低可能导致膜的质量不佳，从而影响其最终的应用性能。4.时间延长：在某些情况下，如果电压太低，可能需要

1 回答418 围观

问请问跑泛素化应该配多大浓度的胶，转膜的电流大小及时间是多少，以及PVDF膜用0.45还是0.22？

百泰派克-李工

1、凝胶的浓度：对于大多数蛋白质，使用 8-12% 的SDS-PAGE凝胶是比较常见的。如果目标蛋白较小（<20 kDa）或者非常大（>200 kDa），可能需要使用更高或更低浓度的凝胶。2、电泳的电流和时间：通常情况下，电泳的电流设置为常电流（constant current）模式，电流大小一般为 15-25 mA（每个凝胶槽）。电泳时间取决于凝胶的厚度和蛋白的大小，通常在1-2小时

1 回答1518 围观

问WB跑出来的条带一片空白，白的发光，是什么原因呢

百泰派克-李工

Western Blot（WB）实验中出现的条带空白且发光（通常指在成像时出现过曝光的现象）可能由以下原因造成：1、样品蛋白浓度过高：如果加载的样品蛋白浓度过高，可能导致信号过强，造成条带处发光。解决方法是稀释样品，减少加载量。2、一抗或二抗浓度过高：抗体浓度过高会导致非特异性结合，增强背景信号。应调整抗体的稀释比例。3、曝光时间过长：如果成像时曝光时间过长，可能会导致图像过曝，呈现白色发光。调整

1 回答4007 围观

问WB实验怎么安排样本顺序？

百泰派克-李工

在Western Blot (WB) 实验中安排样本顺序时，主要考虑以下几点：1、对照样本：将正对照（表达目标蛋白的样本）和负对照（不表达目标蛋白的样本）放在实验的开始和结束位置，以便于结果的比较和确认。2、重复样本：如果实验中包括重复样本，应将重复样本并排放置，以便于结果的比较和分析。3、内参蛋白：确保每组样本中都包含内参蛋白（如GAPDH或β-actin）的检测，以用于加载量的标准化。安排样本

1 回答1938 围观

问WB实验趋势不一致怎么办？

百泰派克-李工

Western Blot（WB）实验中趋势不一致通常指的是重复实验之间结果差异较大。应对这一问题时，主要策略是仔细检查实验的各个步骤，以确保一致性和准确性。具体措施包括：1、样品制备：确保样品的蛋白质浓度一致。使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。确保样品在实验过程中的处理方式一致。2、电泳条件：确保凝胶的制备和电泳条件一致（如电压、时间）。3、蛋白质加载量：确保每次实验加载到凝胶中的蛋白量相同。4、

1 回答1211 围观

问请问WB实验封闭时转速被误调为130r，对结果会有影响吗

百泰派克-李工

在Western Blot实验中，如果封闭（阻塞）步骤的转速被误设为130 rpm，一般情况下对实验结果的影响不大。封闭步骤的主要目的是阻止非特异性抗体结合，而这一过程主要取决于阻塞剂的类型和浓度，以及封闭时间的长度。转速的调整主要是为了确保阻塞剂在膜上均匀分布，避免出现干斑或未覆盖区域。通常情况下，轻微的转速变化不太可能显著影响阻塞效果。不过，如果转速过高可能导致膜的破损或失去样品，而转速过低可

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问为什么用Alix蛋白抗体，实验WB上样细胞裂解液会显示两个条带？哪个为准？

百泰派克-李工

使用Alix蛋白抗体在Western Blot（WB）实验中出现两个条带可能有以下原因：1、蛋白质同源异构体：Alix蛋白可能存在不同的同源异构体，这些异构体在分子量上略有不同，从而在凝胶上表现为不同的条带。2、蛋白质降解产物：如果Alix蛋白在细胞裂解过程中部分降解，这可能导致生成较小的降解片段，这些片段也会被同一抗体识别并在WB上显示为较低分子量的条带。3、磷酸化或其他蛋白质修饰：蛋白质可能因

1 回答601 围观

问转膜marker颜色很浅且感觉条带飞了是为什么

百泰派克-李工

WB转膜出现以上情况可能是由下面几个因素造成的：1.膜转移效率不足：如果膜转移效率不高，可能会导致marker颜色浅。这可能是由于电转膜的电压或时间设置不当，或者使用的膜与蛋白质的亲和力不足。2.样品过载或电泳条件不当：如果样品加载过多或电泳条件不适宜（如电压过高或运行时间过长），可能导致蛋白质条带在凝胶中迁移不均匀，导致转膜后条带模糊或“飞了”。3.膜处理不当：在转膜过程中，膜的处理也非常重要。

1 回答609 围观

问拿到蛋白质组数据后，应该怎么分析，里面什么都有，我要做的是什么？

百泰派克-李工

拿到蛋白质组学数据后，您可以进行一系列分析来提取有意义的生物学信息。蛋白质组学数据分析的步骤和具体目标可能会根据您的研究目的和数据类型（如质谱数据、蛋白芯片数据等）而有所不同。1.质量控制：检查数据质量，确保没有技术误差。2.蛋白鉴定：使用质谱软件与蛋白质数据库匹配，鉴定样本中的蛋白质。3.定量分析：如果涉及比较，进行蛋白质表达水平的定量分析。4.差异表达分析：识别在不同条件或处理组之间表达差异显

1 回答380 围观

问hplc怎么将游离氨基酸和结合氨基酸分开测定

百泰派克-李工

高效液相色谱（HPLC）分离游离氨基酸和结合氨基酸主要是基于它们在分子大小、溶解性和亲疏水性等方面的差异。游离氨基酸是单个的小分子，而结合氨基酸通常存在于蛋白质或多肽中，这些大分子在大小和形态上与游离氨基酸有显著差异。这使得它们在色谱柱中的行为不同。大分子在色谱柱中的洗脱时间比小分子短，因此结合氨基酸比游离氨基酸先洗脱出来，根据收集的保留时间和峰形即可对游离氨基酸和结合氨基酸进行识别和量化。

1 回答470 围观

问WB条带周围一圈浅，中间黑是什么原

百泰派克-李工

WB（Western Blot）条带周围浅色而中间较黑的现象通常是由于蛋白质过载或者检测过敏所致。当样品中蛋白质含量过高，超出了膜的结合能力或者检测系统的线性范围时，就可能出现中间较黑而边缘较浅的条带。这种情况下，中心部分的蛋白质过多，导致抗体饱和，而边缘处蛋白质相对较少，抗体结合不饱和，因此显色反应在中心更为显著。为避免这种情况，可以尝试以下方法：1.稀释样品：减少加载的蛋白质量。2.优化抗体浓

2 回答1019 围观

问求助，小肠蛋白应该怎么提取？想检测小肠zo1表达水平，应该取小肠哪一部分合适？

百泰派克-李工

一、蛋白质提取1、样品制备将选定的小肠部分从实验动物中切除，并立即放入冷的生理盐水中以清洗掉残留的内容物。2.组织均质化3.离心将均质物通过离心分离，以去除未破碎的细胞和组织碎片。通常在4°C下高速离心约10-15分钟。4.蛋白质浓缩和纯化收集含有蛋白质的上清液。此时，可以使用盐沉淀、透析或蛋白质纯化柱等方法进一步纯化和浓缩蛋白质。将提取的蛋白质在适当的条件下存储，如-80°C冰箱中，以防止蛋白质

1 回答600 围观

问两个蛋白有互作，加到缓冲液里共同孵育，缓冲液：蛋白1：蛋白2的体积配比应该是多少

百泰派克-李工

两个蛋白质进行相互作用实验时，缓冲液与蛋白质的体积比通常取决于需考虑多个因素，包括蛋白质的浓度、活性、相互作用的类型和强度，以及实验的特定目的。没有统一的“一刀切”配比。一、配比的选择：一个常见的起点是使用等摩尔的蛋白质，即蛋白1和蛋白2的摩尔浓度相同。例如，如果两个蛋白质的分子量相似，可以尝试按体积1:1混合。然而，根据两蛋白之间的互作类型和亲和力，可能需要调整这个比例。对于低亲和力的互作，可能

1 回答211 围观

问SDS-PAGE电泳marker背景相比于样品背景更加透明，脱色脱的更干净是什么原因

百泰派克-李工

SDS-PAGE电泳中marker（标记物）背景比样品背景更透明、脱色更干净主要是由于：1.蛋白浓度差异：Marker通常是纯化的蛋白，浓度较低，而样品中的蛋白可能浓度较高。高浓度蛋白在电泳后更难脱色。2.样品的其他成分：样品中除了蛋白质外，还可能含有影响染色和脱色的其他成分，如脂质、核酸或其他小分子，这些成分可能会影响染料的吸附和释放。3.蛋白质组成差异：样品中可能含有一些与染料有较强亲和力的蛋

1 回答603 围观

问蛋白质组学里面检索数据库要怎么选择？

百泰派克-李工

蛋白质组学研究中选择合适的蛋白质数据库是关键一步，因为它直接影响到质谱数据的解析和鉴定的准确性。一些常用的蛋白质数据库及其适用情形如下：1.UniProt (Universal Protein Resource)：这是最全面的蛋白质数据库之一，包含了大量物种的蛋白质序列信息。适用于多种物种的蛋白质组研究，特别是那些已经有较完善基因组注释的物种。2.NCBI RefSeq (Reference Se

1 回答421 围观

问请问中药颗粒细胞给药，颗粒要怎么溶解啊？是溶于水还是溶于无血清培养基还是dmso呢？

loveliufudan

关于中药颗粒给细胞实验的溶解方法和用量,建议如下:1. 中药颗粒最好先溶解在无血清培养基或浓度适中的DMSO中,然后再稀释至工作浓度。直接溶于水效果不佳。2. 溶解用的无血清培养基要去掉菌,防止污染。DMSO要制成无水的稀释物。3. 溶解浓度根据颗粒性质而定,一般选择0.1-1 mg/ml的范围,完全溶解。超声波功率可提高溶解度。4. 工作浓度根据实验目的在10-500 μg/ml范围确定,需要先

5 回答1117 围观

问frontiers投稿要求重新提交稿件是什么意思啊

dxy_7hjrvxgq

您好，我也遇到了同样的问题，我想问您最后解决了吗？是什么原因呢？谢谢

5 回答1647 围观

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