实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问为什么每一个条带的边边都是这样的啊/有没有哪位大神遇到过？

dxy_9z1hjq54

什么东西啊，都没有看见图片，谁知道你说啥？

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问阳性位点的点突变突变蛋白不表达

hlj锦衣卫

我有一个蛋白也是，突变后表达量极速下滑。猜想可能是突变体水溶性改变或者折叠异常导致被内在蛋白质控机制给降解了。

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问糖基化修饰在高温变性后会消失吗？

dxy_9z1hjq54

糖基化修饰是一种蛋白质翻译后修饰，它涉及在蛋白质分子上共价连接糖分子。高温变性会导致蛋白质的三维结构被破坏，使得原本紧密折叠的二级、三级和四级结构变得松散或完全伸展为无规则线团（变性态）。然而，糖基化本身是通过稳定的共价键（通常是糖苷键）将糖与蛋白质残基相连，这种化学键并不会因温度变化而立即断裂。

1 回答499 围观

问请问跑泛素化应该配多大浓度的胶，转膜的电流大小及时间是多少，以及PVDF膜用0.45还是0.22？

百泰派克-李工

1、凝胶的浓度：对于大多数蛋白质，使用 8-12% 的SDS-PAGE凝胶是比较常见的。如果目标蛋白较小（<20 kDa）或者非常大（>200 kDa），可能需要使用更高或更低浓度的凝胶。2、电泳的电流和时间：通常情况下，电泳的电流设置为常电流（constant current）模式，电流大小一般为 15-25 mA（每个凝胶槽）。电泳时间取决于凝胶的厚度和蛋白的大小，通常在1-2小时

1 回答1421 围观

问WB跑出来的条带一片空白，白的发光，是什么原因呢

百泰派克-李工

Western Blot（WB）实验中出现的条带空白且发光（通常指在成像时出现过曝光的现象）可能由以下原因造成：1、样品蛋白浓度过高：如果加载的样品蛋白浓度过高，可能导致信号过强，造成条带处发光。解决方法是稀释样品，减少加载量。2、一抗或二抗浓度过高：抗体浓度过高会导致非特异性结合，增强背景信号。应调整抗体的稀释比例。3、曝光时间过长：如果成像时曝光时间过长，可能会导致图像过曝，呈现白色发光。调整

1 回答3618 围观

问WB实验怎么安排样本顺序？

百泰派克-李工

在Western Blot (WB) 实验中安排样本顺序时，主要考虑以下几点：1、对照样本：将正对照（表达目标蛋白的样本）和负对照（不表达目标蛋白的样本）放在实验的开始和结束位置，以便于结果的比较和确认。2、重复样本：如果实验中包括重复样本，应将重复样本并排放置，以便于结果的比较和分析。3、内参蛋白：确保每组样本中都包含内参蛋白（如GAPDH或β-actin）的检测，以用于加载量的标准化。安排样本

1 回答1838 围观

问WB实验趋势不一致怎么办？

百泰派克-李工

Western Blot（WB）实验中趋势不一致通常指的是重复实验之间结果差异较大。应对这一问题时，主要策略是仔细检查实验的各个步骤，以确保一致性和准确性。具体措施包括：1、样品制备：确保样品的蛋白质浓度一致。使用蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。确保样品在实验过程中的处理方式一致。2、电泳条件：确保凝胶的制备和电泳条件一致（如电压、时间）。3、蛋白质加载量：确保每次实验加载到凝胶中的蛋白量相同。4、

1 回答1134 围观

问在高效液相实验中测样品时，用50%的甲醇溶解样品跟用100%的甲醇溶解样品时再上液相测量的话，测量结果有啥不一样嘛？

百泰派克-李工

在高效液相色谱（HPLC）实验中，使用不同浓度的溶剂（如50%的甲醇和100%的甲醇）溶解样品，可能会对测量结果产生以下影响：1、溶解性：不同浓度的甲醇可能会影响样品的溶解度。如果样品在50%的甲醇中溶解性不好，可能会导致样品部分沉淀，这样在高效液相色谱中就无法完全检测到所有的组分。2、峰形和分辨率：溶剂的浓度会影响色谱峰的形状和分辨率。使用不同浓度的甲醇可能会导致色谱峰变宽或变尖，峰形的改变可能

1 回答595 围观

问请问WB实验封闭时转速被误调为130r，对结果会有影响吗

百泰派克-李工

在Western Blot实验中，如果封闭（阻塞）步骤的转速被误设为130 rpm，一般情况下对实验结果的影响不大。封闭步骤的主要目的是阻止非特异性抗体结合，而这一过程主要取决于阻塞剂的类型和浓度，以及封闭时间的长度。转速的调整主要是为了确保阻塞剂在膜上均匀分布，避免出现干斑或未覆盖区域。通常情况下，轻微的转速变化不太可能显著影响阻塞效果。不过，如果转速过高可能导致膜的破损或失去样品，而转速过低可

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问为什么用Alix蛋白抗体，实验WB上样细胞裂解液会显示两个条带？哪个为准？

百泰派克-李工

使用Alix蛋白抗体在Western Blot（WB）实验中出现两个条带可能有以下原因：1、蛋白质同源异构体：Alix蛋白可能存在不同的同源异构体，这些异构体在分子量上略有不同，从而在凝胶上表现为不同的条带。2、蛋白质降解产物：如果Alix蛋白在细胞裂解过程中部分降解，这可能导致生成较小的降解片段，这些片段也会被同一抗体识别并在WB上显示为较低分子量的条带。3、磷酸化或其他蛋白质修饰：蛋白质可能因

1 回答550 围观

问转膜marker颜色很浅且感觉条带飞了是为什么

百泰派克-李工

WB转膜出现以上情况可能是由下面几个因素造成的：1.膜转移效率不足：如果膜转移效率不高，可能会导致marker颜色浅。这可能是由于电转膜的电压或时间设置不当，或者使用的膜与蛋白质的亲和力不足。2.样品过载或电泳条件不当：如果样品加载过多或电泳条件不适宜（如电压过高或运行时间过长），可能导致蛋白质条带在凝胶中迁移不均匀，导致转膜后条带模糊或“飞了”。3.膜处理不当：在转膜过程中，膜的处理也非常重要。

1 回答526 围观

问WB蛋白块，每个颜色都是两边深中间浅请问是啥原因？

百泰派克-李工

在Western Blot (WB) 分析中，如果出现蛋白带两边深中间浅的现象，最可能的原因是样品过载。当在凝胶槽中加载的蛋白质量超过了其分离能力时，蛋白质在电泳过程中可能无法均匀迁移，尤其是在凝胶的中心部位。这会导致蛋白在边缘处迁移得更快或更远，造成带的中间部分相对较浅。为了解决这个问题，可以尝试减少加载到凝胶中的蛋白量，确保蛋白浓度和体积适宜，以便获得更均匀的带。同时，也建议检查电泳和转膜步骤

1 回答846 围观

问磷酸化蛋白质组在过柱富集分析等步骤后，怎么确定蛋白的磷酸化位点的？

百泰派克-李工

质谱技术是确定蛋白磷酸化位点的重要工具，在磷酸化蛋白质过柱富集分析后，接下来的实验流程如下：1、蛋白质消化将富集的磷酸化蛋白质用特定的蛋白酶（如胰蛋白酶）消化成较小的肽段。2、磷酸化肽段富集使用特定的亲和层析技术（如IMAC或TiO2）来富集磷酸化的肽段。这些富集方法能够特异性地结合磷酸化肽段，从而使其从非磷酸化肽段中分离出来。3、质谱分析将富集得到的磷酸化肽段进行质谱分析，最常见的是使用液相色谱

1 回答345 围观

问sds凝胶电泳上样时样品向上浮是什么原因啊？buffer和电泳液的浓度是配套的嘛

百泰派克-李工

SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中样品向上浮的现象通常是由于以下原因造成的：1、样品准备问题：如果样品中含有大量的油脂或是有机溶剂，这些物质的密度可能低于水，导致样品在凝胶中上浮。确保样品在加入上样缓冲液后充分混合和加热，以保证蛋白质充分变性并与SDS结合。2、上样技术问题：在上样时，如果针头没有插入到凝胶的上样孔中，或者上样速度过快，可能会导致样品漂出上样孔。应缓慢、小心地将样品注

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问page胶跑完蛋白染考马斯亮蓝，出现空染是什么情况呢，有时候能染出来，有时候空染。

百泰派克-李工

PAGE凝胶（聚丙烯酰胺凝胶电泳）在使用考马斯亮蓝染色后出现空染（也就是部分区域未染色或染色较浅）的情况可能由多种因素引起：1、蛋白质浓度过低：如果某些泳道中的蛋白质浓度太低，可能导致这些区域染色不明显或看不到条带。2、染色或脱色不均匀：如果在染色或脱色过程中，凝胶未能完全浸没在染色液或脱色液中，或者这些液体在凝胶中分布不均匀，也可能导致空染。3、蛋白质未完全转移到凝胶中：在上样过程中，如果蛋白质

1 回答290 围观

问HIF-1A蛋白纯化

百泰派克-李工

HIF-1α（缺氧诱导因子1α）是一种在缺氧条件下表达的转录因子，它在细胞适应缺氧环境中发挥重要作用。蛋白质纯化是一个复杂的过程，涉及多个步骤，确保获得高纯度和活性的蛋白。以下是一个基本的HIF-1α蛋白纯化步骤概述：1.细胞裂解：如果HIF-1α蛋白在细胞内表达，首先需要裂解细胞以释放蛋白。通常使用裂解缓冲液（含有非离子洗涤剂如Triton X-100或NP-40，以及蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解

1 回答336 围观

问wb实验时蛋白加热变性后有沉淀

百泰派克-李工

在Western Blot (WB) 实验中，蛋白质加热变性后出现沉淀是一个常见问题。通常由以下几个因素引起：1.蛋白质浓度过高：如果样品中的蛋白质浓度过高，加热时可能会导致蛋白质过度聚集和沉淀。2.样品缓冲液不适当：使用的样品缓冲液可能不适合所分析的蛋白质。例如，缓冲液的pH值或盐浓度不适当可能会影响蛋白质的溶解性。3.加热时间或温度不适宜：过高的温度或过长的加热时间可能会导致蛋白质结构受损，从

2 回答1907 围观

问过表达的带FLag标签的蛋白，可以用目标抗体检测到很强的带，但没法用标签抗体Ｗｂ检测到标签。原因是什么？

百泰派克-李工

在表达带有FLAG标签的蛋白时，如果可以用目标抗体检测到强烈的条带，但无法用标签抗体通过免疫印迹（Western Blot, WB）检测到标签，可能有几个原因：1.标签抗体的特异性或活性问题：可能是Flag标签抗体的特异性或活性不足。可能是抗体本身的问题，或者抗体已经过期或在储存过程中活性下降。2.标签位置的问题：Flag标签的位置可能影响抗体的识别。如果标签位于蛋白的内部或者被蛋白的其他部分遮挡

1 回答1596 围观

问蛋白在酶切之前就分成了相隔很近的两条带，在酶切后两条带分别减少，过akta后还是会出现相隔很近的两条带是什么原因，怎么解决？

百泰派克-李工

蛋白在酶切之前就分成两条相隔很近的带，并且在酶切和经过AKTA纯化后仍然出现这种现象可能有几个原因：1.蛋白异构体：可能存在蛋白的不同异构体或者蛋白质的不同翻译后修饰形式，如磷酸化、糖基化等。2.蛋白部分降解：蛋白可能在提取或处理过程中发生了部分降解，导致出现大小略有差异的多个片段。3.酶切不完全：如果两条带在酶切后分别减少，可能是酶切不完全导致的。酶切不完全可能是由于酶的活性不足、反应时间不够或

1 回答261 围观

问T2细胞结合力试验

大壮TCCZ

想知道不加的话做出来了吗，我的没有加一直都没有阳性结果，想知道是不是这个原因555

3 回答1418 围观

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