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        硝酸还原酶活性测定对照(空白)制作的具体步骤,需要加哪些东西?

        相关实验:离体法植物体内硝酸还原酶活性的测定实验

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        dxy_iny0q4o2


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        3 个回答

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        硝酸还原酶活力的测定

        1、试剂:

        (1)亚硝态氮标准溶液

        称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL,然后再吸取1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。

        (2)0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液

        称取30.0905 g Na2HPO4·12H2O与2.4965 g NaH2PO4·2H2O,加无离子水溶解后定容至1000mL。


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        小小翻车鱼

        有帮助

        以下是硝酸还原酶活性测定对照(空白)制作的具体步骤:


        1. 准备试剂:准备好所有需要的试剂和溶液。通常,这些试剂包括:

        - 提取缓冲液(如50 mM磷酸缓冲液,pH 7.8)

        - 硝酸盐(如NaNO3)

        - 光还原剂(如亚硝酸钠,NaN3)

        - 增强剂(如有必要)

        - 沸水浴


        2. 准备对照样本:

        - 取一份与待测样本等量的提取缓冲液,作为对照样本的提取缓冲液。

        - 在对照样本的提取缓冲液中加入与待测样本相同体积的硝酸盐溶液。

        - 如有必要,加入与待测样本相同体积的增强剂溶液。


        3. 混合和对照处理:

        - 将对照样本的提取缓冲液、硝酸盐溶液和增强剂溶液(如使用)充分混合。

        - 将对照样本与待测样本同时进行相同的处理步骤,如提取、离心、加入光还原剂等。


        4. 空白对照测试:

        - 在进行NR活性测定时,将与照样本的试管与待测样本的试管一起进行光还原反应。

        - 反应完成后,测量对照样本中的亚硝酸盐生成量。这将作为NR活性测定的阴性对照,以消除非特异性结果的干扰。


        5. 数据分析:

        - 将待测样本的亚硝酸盐生成量减去对照样本的亚硝酸盐生成量,得到NR活性的净生成量。

        - 根据实验条件和试剂浓度,将净生成量转换为NR活性单位,如纳摩尔每分钟每毫克蛋白质(nmol/min/mg protein)。

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        粥辰辰辰辰

        有帮助

        .仪器设备


        高速离心机、分光光度计、部分收集器、研钵等。


        2.操作方法


        1)酶的粗提液:材料可用植物的叶、茎、根,发芽的种子,离体胚和培养的细胞等,以发芽3~5d的小麦幼苗叶片提取较为简便。剪取材料,洗净吸干并切成小块、放在研钵中冷冻30 min后加入少许石英砂及磷酸缓冲提取液(25mmol/L磷酸缓冲液加1mmol/L EDTA和10 mmol/L半胱氨酸,pH8.8),研磨成匀浆(材料多时可用捣碎机),匀浆用2层纱布过滤,清液用30000×g离心15min,得到的上清液即为酶的粗提液。整个过程必须在4℃下进行。


        2)酶的活性测定:吸取0.5ml KNO3溶液、0.3ml NADH和0.2ml酶粗提液。混合后在25℃下保温30min。保温结束后,立即加入0.5ml1%氨基苯磺酰胺和0.5ml萘基乙烯二胺水溶液。静置15min以上,用分光光度计在540mm处测定光吸收。以不加NADH的(加入0.3ml水)作空白对照。


        样品的光吸收减去空白对照的光吸收等于光吸收的增量。光吸收的增加即此1ml反应液中,在保温30min内,由于酶的作用而增加的NO2-数量。从标准曲线中计算该光吸收的增量相当于多少微克的NO2-。


        3)酶的纯化:硝酸还原酶易于失活,近年来常用亲和层析法进行纯化。在粗酶液中加入固体(NH)2SO4,达到20%饱和度,调pH至7.5,置于4℃下15min,15000×g离心15min,弃去沉淀。上清液中再加入固体(NH)2SO4到40%饱和度,4℃下放30min。再用15000 ×g离心15min,弃去上清液。将沉淀物溶解在小量的磷酸钾缓冲液中(25mmol/L,pH 7.5)。然后用Blue Dextran Sepharose进行亲和层析。此外,也可直接用粗酶液上亲和层析柱。

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