类器官培养与应用——肠类器官

肠上皮是成年哺乳动物中自我更新最快的组织，平均自我更新时间少于 5 天。

肠干细胞位于肠隐窝（intestinal crypt）底部附近，每个隐窝中的干细胞大约有 4-6 个，它们产生快速增殖的转运扩增 (TA) 细胞，肠细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞都从 TA 细胞发育而来。

TA 细胞快速分裂、转运扩增的子细胞占据了隐窝的其余部分，并流向绒毛的侧面，在那里它们分化、吸收营养，最终在绒毛尖端凋亡^【1】。

在体外可以由 hPSCs 来模拟胚胎肠发育的过程，通过添加高浓度的 FGF4 和 Wnt3A，促使 hPSCs 衍生的终内胚层 (DE) 向中肠和后肠内胚层分化，并促进肠管样形态发生，进而产生包含吸收性肠细胞以及主要分泌谱系(包括 Paneth 细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞)的肠类器官。

本篇文章基于 Nature protocols^【2】 整理了 hPSCs 细胞来源的肠类器官培养方案。

 

细胞来源

hPSCs

 

培养基配方

	第 1 天内胚层分化培养基	第 2 天内胚层分化培养基	第 3 天内胚层分化培养基	中肠和后肠分化培养基	肠生长培养基	近岸蛋白产品货号
基础培养基	RPMI-1640	RPMI-1640	RPMI-1640	RPMI-1640	DMEM-F12
penicillin-streptomycin	penicillin 100U/ml, streptomycin 100μg/ml
dFBS（v/v）	-	0.2%	2%	2%	-
L-glutamine	2mM
B-27	-	-	-	-	1×
HEPES	-	-	-	-	15mM
Activin A	100ng/ml	100ng/ml	100ng/ml	100ng/ml	-	C687
FGF-4	-	-	-	500ng/ml	-	CR08
Wnt3a	-	-	-	500ng/ml	-	C06D/C18K
Noggin	-	-	-	-	100ng/ml	CB89
R-spondin 1	-	-	-	-	500ng/ml	CX83
EGF	-	-	-	-	100ng/ml	C029

 

hPSCs培养和传代

1、将冻存的 Matrigel 在 4°C 下过夜解冻，在 6 孔板的每孔滴加 1ml 冷的 Matrigel，旋动 6 孔板使 Matrigel 溶液分布均匀。随后转移至 37℃ 条件下孵育 10min 使其凝固，使用前需室温静置 1h。

2、将 hPSCs 接种在包被 Matrigel 的 6 孔板中，每孔加入 3ml mTeSR1，放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中，培养至细胞融合度约为 75–85%、且大部分无分化的状态时，吸出培养基。

3、向 hPSCs 中加入 1 ml Dispase（1mg/ml），并将培养皿放置在 37℃ 条件下进行解离，直到所有的细胞都以小细胞块或单细胞的形式漂浮。向每个孔中加入 5ml的DMEM-F12，以充分稀释 Dispase。

4、将所有细胞转移至离心管中，室温下 300g 离心 3min，收集沉淀细胞。加入 DMEM-F12 培养基，以 1:6 的比例接种在 Matrigel 包被的 24 孔培养板中，向每个孔中加入 0.5ml 预热的 mTeSR1 进行培养，在 2-4 天内细胞汇合度达到 85-90%。

 

hPSCs 分化成 DE

5、吸出 mTeSR1，向每个孔中加入 5ml 预热的第 1 天内胚层分化培养基，并将平板放回 37℃，5%CO₂ 的培养箱中。

6、24h 后，吸出第 1 天内胚层分化培养基，替换为每孔 5ml 预热的第 2 天内胚层分化培养基，并将平板放回 37℃，5%CO₂ 的培养箱中。

7、24h 后，吸出第 2 天内胚层分化培养基，替换为每孔 5ml 预热的第 3 天内胚层分化培养基，并将平板放回 37℃，5%CO₂ 的培养箱中。

8、24h 后，吸出第 3 天内胚层分化培养基，用不含 Activin A 的第 3 天内胚层分化培养基洗涤细胞一次。此时在显微镜下观察细胞，应该存在扁平的 DE 组织，该组织包含非常少的 3D 结构。

 

DE 分化为中肠和后肠

9、从 24 孔板中吸出培养基，每孔滴加 5ml 预热的中肠和后肠分化培养基。每 24h 更换一次新鲜中肠和后肠分化培养基，直至 96h 。

10、在立体显微镜下，可以看到明显的 3D 结构。使用 200μl 移液器吸头从每个孔中收集球状体，并将大约 50 个球状体集中到 5ml 微量离心管中。

 

中肠和后肠球状体生长成人肠类器官

11、收集球状体后，将微量离心管垂直放置在管架上 10min，此时球体通过重力沉降到离心管底部。吸出上清，控制总体积在 25μl 左右。

12、将冻存的 Matrigel 在 4℃ 下过夜解冻，添加 B-27 补充剂(终浓度 1×)、R-spondin1 (终浓度 500ng/ml)，Noggin (终浓度100ng/ml) 和 EGF (终浓度100ng/ml)，用移液器吹打混匀，配制成肠基质胶。

13、将球状体滴加在预冷的肠基质胶中，并将样品混匀，总体积将达到 75μl (50μl 基质胶+ 25μl 培养基+球状体)。

14、将混合物接种在 4 孔板中，注意需接种在孔的中心，避免接触侧壁。

15、将 4 孔板放入 37℃，5%CO₂ 的培养箱中孵育 10min，使 Matrigel 固化。

16、向每个孔中缓慢滴加 5ml 肠道生长培养基，确保基质胶被完全覆盖。

17、每隔 4 天，或当培养基中的酚红变黄时，更换肠生长培养基。

 

肠类器官传代

18、在第 14 天左右，通过将肠类器官重新包埋在新鲜的 Matrigel中，来实现传代。

19、在显微镜下观察类器官，吸出孔内的培养基，加入少量 DMEM-F12 培养基。

20、使用 200μl 移液器吸头用力上下吹打 Matrigel 3-5 次，释放 Matrigel 中的类器官。

21、在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中培养组织 14 天，每 4 天更换一次肠道生长培养基。

图1. 人肠类器官的培养过程^【2】

 

肠类器官的最新应用进展

肠道类器官可以在体内移植，作为再生医学的临床前工具。

2022 年 2 月日本学者 Satoshi Watanabe 等人^【3】利用右旋糖酐硫酸钠给药，在结肠远端引发上皮损伤，随后将肠道类器官原位移植到受体小鼠的结肠中，实现了上皮细胞的重建。

这一步骤可在 10 分钟内完成，为肠类器官治疗溃疡性结肠炎的临床试验奠定了基础。

图2. 肠类器官（绿色）在移植 1 周后，成功整合到小鼠上皮损伤的区域^【3】

 

参考文献

【1】SATO, Toshiro, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009, 459.7244: 262-265.

【2】MCCRACKEN, Kyle W., et al. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2011, 6.12: 1920-1928.

【3】WATANABE, Satoshi, et al. Transplantation of intestinal organoids into a mouse model of colitis. Nature Protocols, 2022, 1-25.