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科研学霸天团，48小时有问必答

问Annexin V 法测细胞凋亡时的阴性对照是什么意思？

赵栋2012

matianzhong战友回答：Annexin V测凋亡一般与PI联合用，Annexin V与早期凋亡细胞膜结合来检测，PI只能进入死细胞和晚期凋亡。制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：1. 没有染色的细胞。2. 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞。3. 仅用PI染色的细胞。

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问为什么抗原修复结果里假阳性很多？

tao0129

1.抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来。2.免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果。3.而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，故不需抗原修复。4.第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可。

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问我做得是贴壁细胞，可以不用多聚甲醛固定吗？

rayh9

1.活细胞对各种大分子通透性都差，不固定的话，后面的实验无法进行。多聚甲醛固定是常规选择，2.可以BSA封闭3.尽量创造类似条件，减少液体挥发4.尽量吸干，滤纸就行了，枪头吸不干

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问TUNEL 法的实验原理是什么？

tao0129

基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视

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问细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？

tao0129

1.蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；2.蛋白酶K一般工作液浓度为20 ug/ml ，但浓缩液可配制1~10 mg/ml ，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 um 左右的片子可以用10

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问TUNEL 实验中几个关键步骤是什么？

tao0129

1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20 min，再用二甲苯两次5~10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30 min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1 h

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问求问红细胞凋亡实验原理和步骤？

我是金博士

这里有一篇比较老的文献，供你参考，另外万方和维普中有很多相关研究的。http://www.biomart.cn/experiment/430/488/498/33578.htm

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问冻存细胞复苏后，可以再做流式检测细胞表型吗？

alaling

只要你的冻存复苏条件都按程序来，即确保细胞复苏成功，就可以做了当然细胞复苏后最好是培养一段时间使细胞调整到正常状态

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问微波修复时是否该阻断？

赵栋2012

1. 微波修复的目的是什么？在免疫组化中是用来抗原修复，暴露抗原决定族，利于抗原抗体反应；而罗氏细胞凋亡试剂盒说明书中应该也没有提及抗原修复吧？2. TUNEL检测细胞凋亡原理是用来测定DNA断裂的3‘-OH和TDT-dUTP结合，他们的结合反应不是抗原抗体反应原理，该方法的关键是如何使TDT-dUTP等试剂充分进入细胞核内进行反应，所以应该有细胞通透这一步骤，用蛋白酶K、Triton等均可。3.

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问求新购买的昆虫细胞sf9详细的复苏方法

我是金博士

下面是我复苏细胞的一些经验，不知可否对你有所帮助。1、在复苏细胞前，调好水浴锅温度至37度，并保持恒温，检查离心机的转速（900rpm）与时间（4min）。2、在超净台中，准备好无菌离心管、吸管及培养基等必需的无菌用品。快速移到37度恒温水浴锅中，并同时摇动冻存管，以加速溶解（注意：此步中，冻存物溶解所用的时间越短越好，但是水浴锅温度一定恒定为37度）。4、待冻存物溶解后，将其转移至10ml无菌离

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问PM是一种什么毒株？

云天昊

PV是减毒毒株，pm为固定毒株

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问实验中怎样染色才会达到最佳程度？

赵栋2012

初次做凋亡，一般按照试剂盒说明书做即可，但要附上阳性对照。根据结果进行对实验过程调整。我个人认为试验过程中tunel酶反应的时间、过氧化氢的灭活时间、DAB染色时间、苏木素复染时间、PBS浸洗时间等都可以通过上次试验结果进行微调从而使试验染色达到最佳。

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问荧光显像后用什么封片？

赵栋2012

一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。

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问如何测定特定细胞的周期时间？

ljjl8310

没有诀窍吧？只能每天进行检测吧？

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问为什么 SD 大鼠神经干细胞培养时候会出现贴壁现象？

kudy

一般不会贴壁，贴壁的多是神经元样及胶质细胞

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问密度梯度离心里 Conc.6% 是什很么意思？

clujyh430

分离液的浓度为6%,这个是以前的产品，sigma有最新的

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问请问用 6 孔板做划痕实验一般划几行？为什么要 marker 笔在底部画直线，会对拍照造成影响吗？

兵兵兵兵小

在底部画线是为了划痕时候能有一个大概得参考，拍照时候用酒精棉擦掉就好。

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问是否罗氏的试剂盒并不需要后面的脱水、透明步骤？

tao0129

罗氏凋亡试剂盒有两种方案。1 一种荧光显微镜观察和一种DAB显色。因为他用的是荧光素标记的dUTP，若用荧光显微镜观察，那后面的酶标记抗荧光素抗体就不要孵育了，也不要脱蜡透明，只要用抗荧光催灭封片液封片即可。2 而后者还是需要进行POD-抗荧光素抗体孵育，最后还要进行脱蜡、透明和中性树胶封片。

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问肿瘤细胞诱导血管生成模型，有相关中外文文献么？

1473 围观

问TUNEL 法检测细胞凋亡可以直接在孔板上做吗？

fly620

做成细胞爬片后，染色，避光孵育会比较方便，六孔板中的细胞不能用油镜观察。

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