pk18mobsacb基因敲除

相关实验：基于 CRISPR／Cas9 系统的动物基因敲除技术

实验室小助理夏奇

2023-05-29

最近在做谷氨酸棒状杆菌基因敲除，原始菌株是在之前做过敲除的同时敲入。目前敲除第一轮卡那筛选PCR验证得到了目的条带，验证引物设计在上下游同源臂，敲除后条带为800。将转化子挑至无抗的LB培养基30隔夜培养后，稀释涂布至蔗糖培养基上，结果长了满板。PCR验证也没有条带。有没有大佬指导一下啊，重复很多次了，也重新做过感受态。图片描述

3 个回答

可欣OTQ7

2023-07-21

有帮助

蔗糖糊板两种可能，第一你去看看自己的菌的全基因组里是否本身就自带SacB的基因，有这个基因，就不能发生第二次重组。第二种情况就是你的第一次重组失败了。如果你的菌野生行都可以在kan上长，那么恭喜你，需要改载体，改成你的菌不抗的抗性再往下做。解决方案:确定自己的菌对哪个抗生素有抗性，而载体上没有的抗性。然后第一次重组用双抗去做。再挑菌，这时候把单克隆挑起来先画蔗糖，同一个枪头，又去再单抗性kan上涂。然后第二天，选择蔗糖上不长的，抗性板上长的。把这些菌全部LB摇，摇了涂板，只要糊板子的都丢了，没有糊的继续培养，后面你就可以做验证了。