流式细胞周期结果没有S期，是什么原因

最近，做药物对肿瘤细胞周期的影响；结果没有S期（Modfit软件都提示没有S期），是什么原因，求大神解答。在另外一株细胞中的结果也是一样。

（1）会不会是由于细胞太少了？因为我铺板的密度比较稀，细胞数较少，最终收集得到的细胞比较少？

（2）是否跟染色相关？PI室温染色30min，然后放置冰上待上机。是否染色时间再延长些会使S期提高？

（3）另外，想了解，我这样圈门是否正确？

操作过程如下：

1、细胞铺板密度1.8乘以10的5次方，24h后药物刺激，再24h后收集细胞，

2、加1mlPBS，再加3ml 95%乙醇，-20℃过夜

3、500g 5min离心除上清，加入3ml PBS洗两遍

4、加入PI染色，室温染色30min，上机

5、Plot 1（FSC-A/SSC-A）---Plot 2（FL2-A/FL2-H）---Plot 2（FL2-A/Count）

对照组

实验组