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        毕赤酵母表达跨膜蛋白

        相关实验:毕赤酵母中的表达实验

        user-title

        dxy_5dq7x910

        我用毕赤酵母x-33菌株和pPICZαA质粒,来表达分子量50KD左右的跨膜蛋白(已截掉跨膜区域),表达条件28℃,250rpm,离心取上清做WB和考蓝均无条带,求问原因图片描述

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        4 个回答

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        可能的原因有:

        1、上样时没有目的蛋白,可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了;

        2、目的蛋白结合在FPLC柱子上没被洗脱;

        3、目的蛋白穿透FPLC柱子,在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰;

        4、电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到。

        5、要看吸收值,如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。

        user-title

        sswei

        有帮助

        样品中可能含有蛋白酶,使蛋白样品分解成小分子。目标蛋白浓度过低(低于检测下线)。转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上,或者转膜时间过长导致样品转穿。一抗的特异性不佳,导致一抗无法识别目标蛋白。一抗反复使用后导致效价降低,尽管还能与目标蛋白连接,但连接蛋白的数量太少。洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        考虑体系内存在蛋白降解,所以没有条带显示

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        表达条件和表达时间可能是影响表达的因素之一。有些蛋白需要更长时间才能表达出来,建议您将培养时间延长至更长时间(例如24小时或更久)并再次尝试 WB 和考蓝染色。同时,您可以考虑增加表达条件(如温度、培养基、诱导剂浓度等)来提高表达水平。此外,还应检查您的质粒是否正确、酵母是否正常生长以及蛋白质是否被顺利转录、翻译和折叠。如果以上因素都不是问题,那么您可能需要重新设计和构建表达载体或更换宿主菌株。

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