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        请教法夫酵母原生质体转化的具体方法。

        相关实验:外源基因在真核细胞中的表达

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        dxy_kn3xxo30


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        3 个回答

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        huarenqiang5

        有帮助

        首先利用Macerozyme(离析酶)降解叶片组织中的果胶物质,分离成单个细胞,然后利用Onozuka纤维素酶降解细胞壁,从而分离原生质体。

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        土井挞克树

        有帮助

        原生质体感受态制备方法包括:

        1.去除法夫酵母多余的质粒或载体,通过 PCR 检测或酶切鉴定筛选转化株。

        2.通过药物筛选筛选出感受态转化株。

        3.通过酶切鉴定或测序鉴定来确定基因插入的位置和数量.

        4.通过实验验证基因功能,如蛋白表达,酶学活性,生理活性等.

        5.通过质粒分离和测序确定转化株的纯度。

        这些感受态制备方法可以帮助确定转化株的纯度和基因插入的位置,确保转化株的高效性和准确性.

        user-title

        高山云初

        有帮助

        酵母感受态细胞的制备

         

        1.在YPDA培养基上接种酵母AH109菌株。培养时间≤4周。菌落直径为2-3 mm、在15 mL离心管中加入3 mL新鲜的YPDA液体培养基、每个离心管中一个菌落、30℃, 250rpm、 8h。

         

        2.吸取10μL种子菌加入到含有50 mLYPDA的250 mL三角瓶中、 30℃, 250rpm、 16-20 h。测OD600=0.15-0.3,将培养液移至50 mL离心管中。室温、 700 g 离心5min。

         

        3.弃上清、用100 mLYPDA液体培养基重悬菌体、用500 mL三角瓶摇。 30℃。250rpm、 3-5h。

         

        4.测OD600=0.4-0.5,将菌液分装到2个50mL离心管中。室温,700g离心5min。

         

        5.弃上清。每管中加入30mL去离子超纯水、重悬菌体。 700g离心5min。

         

        6.弃上清,用3 mL 1.1×TE/LiAc悬浮菌体、吸出分装到2个1.5 mL离心管中,12000 rpm 离心 15-30 s。

         

        7.弃上清,每管中加入 600 uL 1.1xTE/LiAc 重悬菌体,备用。

         

        注意:制备出的感受态必须马上使用。

         

        二、酵母共转化

         

        1.在1.5 mL离心管中加入、两种质粒各>200 ng

         

        3-5μL已变性的鲑鱼精DNA100μL酵母感受态

         

        600μL新配制的PEG/LiAc。轻轻混匀,可吸打、

         

        2.30℃热板放置30min。每10min混匀一次。

         

        3.加入70μL DMSO。缓慢混匀,caution。一定要缓慢、。

         

        4.42℃热板热击20 min。每5 min缓慢摇匀一次、caution。一定要缓慢。。

         

        5. 12000rpm离心15-30s,弃上清。

         

        6.加入150μLYPDplus。 30℃热板放置30min或者30℃。 250rpm、 30 min。

         

        7.12000 rpm 离心 15-30 s,弃上清。

         

        8.用600μL0.9%。w/v, NaCl悬浮菌体。

         

        9. 涂于二缺板

         

        10.吸取5μL点在相应的缺陷平板上。每个组合按照10倍或5倍梯度稀释点2-4个点。

         

        11.30℃培养2-3 d

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