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        线性化片段转入毕赤酵母SMD1168

        相关实验:外源基因在真核细胞中的表达

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        科研民工Fine

        转入片段浓度约为1-2ng,重复电转了很多次,在G418抗性的MD平板上筛选阳性转化子,挑单菌落扩PCR鉴定,总是没有条带

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        3 个回答

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        汤姆卜丽波

        有帮助

        你验证过片段是对的的话,如果是转了很多次都没有都没有阳性,那有可能是你的感受态细胞出了问题,就是转不上去

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        土井挞克树

        有帮助

        很可能是你单菌落所含的片段太少,建议先扩增再做鉴定

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        loveliufudan

        有帮助

        有可能是以下原因:

        转入片段质量问题:请确保您的线性化片段纯度和完整性足够好。使用质量较低的片段可能导致转化效率降低。您可以通过琼脂糖凝胶电泳检查片段的质量。

        电转条件优化:请确保使用适当的电转条件,如电压、电容和脉冲时间。电转条件不当可能导致转化效率低。您可以尝试使用不同的电转参数组合来优化条件。

        转化效率:确保您使用的毕赤酵母SMD1168细胞具有较高的转化效率。在进行实验之前,可以通过使用已知浓度的质粒DNA进行转化试验来测试细胞的转化效率。

        鉴定方法优化:请检查您用于PCR鉴定的引物是否正确,同时确认PCR扩增程序中使用的退火温度、延伸时间等参数适当。PCR扩增程序不当可能导致条带缺失。

        抗性筛选:请确保使用的G418浓度适中。使用过高的浓度可能导致阳性菌落无法生长。您可以通过对照试验测试不同G418浓度以找到最适合的筛选条件。

        细胞恢复:转化后,请确保将细胞在不含G418的培养基中恢复一段时间,让细胞修复受损的膜结构并表达抗性基因。通常,恢复时间可以在1-3小时之间。

        质粒设计:请确保您的质粒设计正确,具有适当的启动子、终止子以及用于酵母表达的抗性基因。

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