免疫组化的问题求助？

DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就被覆盖，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗 体孵育时间；

此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。

用pbs多清洗几次，考虑是染剂浓度过大

可能是苏木素染色不均匀或者染色时间过长导致的。建议您可以尝试以下方法：

确保苏木素染色的浓度准确。您提到的苏木素配制是将5 mL 原液加入20 mL 蒸馏水，但是原液的浓度可能会因品牌和批次的不同而有所差异。因此，最好检查一下您使用的苏木素原液的浓度是否正确，并且确保正确计算配制液的浓度。

确保苏木素染色的时间不要过长。苏木素染色时间太长可能会导致颜色过深，从而覆盖DAB染色的棕黄色。您可以尝试缩短苏木素染色的时间，或者减少苏木素原液的浓度来避免过度染色。

检查组织切片是否存在问题。如果组织切片存在问题，例如表面存在气泡、破裂或滑片时移动，可能会导致苏木素染色不均匀或者DAB染色被覆盖。因此，建议您检查组织切片是否存在这些问题，并重新制备和染色切片。