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科研学霸天团，48小时有问必答

问请问在免疫扩散法中，根据规程最好能先将血清（抗体）样本进行补体灭活处理后再使用，如果不灭活会有什么影响呢，灭活时有什么注意事项？

dxywode

免疫扩散法：先制备含Apo抗体的琼脂糖凝胶，间隔等距离打孔，加入待测人血清，水平置于温箱（37℃）保温24或48h，抗原从孔中间向周围扩散，因凝胶板中有相应抗体，经一定时间扩散后，医学教|育网搜集整理最后在凝胶孔周围形成一圆型沉淀圈，测量其圆直径，以圆的面积大小计算血清中Apo含量。该法要求在测量圆周大小时，一定要精确到0.1mm.这一测定方法可适用于以抗体为试剂贩所有微量蛋白的测定，但易受多种因

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问实验中，双向免疫扩散实验测得抗体效价为1：2，而ELISA实验测得得抗体效价却是1：32000，为什么差距？这么大？

府宅

在筛选抗体的时候，要看抗原表位位置，如果是线性表位，重组蛋白筛选没问题，如果非线性表位或者复杂结构包含着的，如果用重组蛋白表达出来，表位结构可能与真实结构不一致，从而导致筛选出来的抗体，并非真实表位相对的抗体，所以ELISA结果会有差距大

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问肿瘤疫苗沉渣泛起的原因都有哪些？一定不能使用么？

府宅

疫苗中不溶于水的成分，以混悬液的状态存在。放置久了，瓶底会有少许沉淀，轻轻振摇后，沉淀会与悬液混溶。这是正常情况，不影响疫苗的使用。

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问细胞染色背景应该如何降低

府宅

内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

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问石蜡切片染色要到什么程度呢？虽然是半定量的一个方法，太深太浅都对数据有影响。

桐轩456

我觉得这个程度只能是自己去分辨，每一步都必须准确操作，因为染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响，再说不同染色液染色后处理也不一样，所以一般只能根据镜下观察所见予以调整，然后再根据实验室的实际情况灵活掌握。

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问外周血单个核细胞分选方法的比较

dxywode

免疫磁珠细胞分选法是把细胞用超级顺磁性的(MACS微型磁珠)特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。

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问如果上样量超载，要用什么样的方法增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚？

府宅

柱超载法，通常指在分离条件不变的基础上增大进样量。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。超载进样的程度取决于分离情况。超载一般分为体积超载和浓度超载。

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问跑胶跑成斜线，是胶的问题还是电流的问题

wuli猫宁

胶带跑偏的调整工作，应在空载运转时进行。一般从机头卸载滚筒开始，沿着胶带运行方向，先调整回空段，后调整承载段。调整时，应在一侧进行调整，切勿两侧同时调整，并且一次调整的幅度不能过大，要根据胶带运转情况适当调整。

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问肿瘤蛋白疫苗为什么要加强注射一针？

Kimser

疫苗的作用就是增加其含量，含量之所以少也是通过检测，原因在于消耗速率和起始浓度。

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问ELISA中用到的试剂都是哪些?

lzy必有我师

1、包被缓冲液：0.05mol/L，PH9.6碳酸盐缓冲液（CBS） Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 加去离子水水至900ml，调pH值到9.6,定容到1000ml。121℃，0.1MPa高压灭菌20min后，室温贮藏。 2、磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）：0.01 mol/L、pH7.4 NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g KCl 0.2g Na2HPO4·12H2O

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问吸附抗体的选择，非稀释，稀释？

dxywode

选择抗体应先了解其反应谱和适用条件（包括适用切片、稀释度及温育时间等）。使用一种新抗体时，必须首先摸索出最佳浓度，所谓最佳浓度就是能获得最佳特异反应所需抗原的最低浓度。或者按照有关说明书的提示。二、稀释1.一般用0.01MPBS，PH值7.2；2.或用0.05MTBS，PH值7.6；

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问为什么细胞培养需要用到血清？

bqejjh123

加入动物血清是为了给体外培养的细胞提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶,可以促进细胞的发育。

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问做wb实验每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？

bqejjh123

最好不要，根据抗体而定，只是基础成分一般都是TBST或PBST。抗体说明书会写到底加BSA还是NF-MILK。有钱还可以买专用稀释液，特异性进一步降低，成分可能包括人工合成的肽、明胶、酪蛋白、多糖类等。

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问免疫组化染色检查是比较前沿的一种检查方法，可以用来判断肿瘤的早中晚期嘛？

Lv花开花落

肺癌的免疫组化染色检查是一种确诊肺癌类型的检查方法。肺癌的免疫组化分析可以帮助判断肺癌患者的具体病理类型。对于缺少组织形态学特征的肿瘤，主要依靠其免疫组化，作为重要的诊断依据，判断免疫组化染色为弥漫强阳性的标准为。

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问请问现在T细胞常见的抗体有哪些？

府宅

T 细胞（全部）CD3细胞膜细胞膜受体杀伤性 T 细胞CD8细胞膜细胞膜受体杀伤性 T 细胞IFNγ, TNF分泌细胞因子杀伤性 T 细胞EOMES

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问目前有耗尽型T细胞的抗体吗？

dxy_gwrp7ndq

免疫T细胞彻底耗竭与DNA甲基化过程有关

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问关于免疫荧光细胞效率的问题

府宅

内源性原因就是你的细胞长的太密了。外源性可能是你转染造成的。还有可能更你做一抗二抗有关。

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问关于chip-seq或者cut-tag的问题

府宅

ChIP-seq可以不设置生物学重复；如果设置生物学重复，要尽可能增加重复个数。

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问免疫共沉淀检测到蛋白信号弱的原因是什么呢？

府宅

抗体浓度太低，应对措施：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度；

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问免疫组织化染色试剂配制和操作步骤？

dxywode

1. 标本预备①白腊包埋组织切片：由病理室通例处理②冰冻组织切片：由病理室通例处理③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞,待细胞发展达到60％以上后掏出玻片,4%多聚甲醛固定2 h.2. 试剂预备①抗体选择单克隆抗体针对单一表位,具有较高的特异性,但在该表位损坏后将得不到阳性成果;多克隆抗体表位针对多个表位,可防止单克隆抗体的缺陷,但是可能消失非特异性杂交.是以,不管选择单克隆照样多克隆抗

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