实验问答22,003,592 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问免疫荧光: 冲洗时，用PBS和PBST效果会有差别吗？用PBST背景色会明显降低？)

冷泉港蛋白

一、会有差别，PBST会好些。二、原因在哪里？1.看下PBST比PBS多T,T是一般是TWeen 20.2.结构决定功能：TWeen 20是两性表面活性剂，一头疏水，一头亲水，因此它可以洗脱掉由疏水相互作用所产生的非特异性吸附，一定程度上降低假阳性。3.常用浓度：TWeen 20通常使用的浓度是0.1%，这与它的CMC有一定关系

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问免疫荧光加完一抗之后，需要室温孵育一会吗？还是直接4℃过夜就可以了？

whilt-shirt

直接4℃过夜就行，这样效果会好一点

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问流式细胞术检测胞内因子

Eason老歌迷

可以参考这篇文献”检测靶向治疗后急性T淋巴细胞白血病的试剂组合物及其应用的制作方法”，讲的很详细。

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问应激颗粒免疫染色特异性低

Eason老歌迷

特异性弱，可能有几个原因。一个是标本固定、包埋不当。固定剂不佳、固定时间过长、浸蜡包埋温度过高，会导致抗原完全破坏，这些都是常见原因。由于不同的抗原对环境耐受性不同，有些标本虽然能做出一些较好的指标，但不稳定和含量低的抗原可能已消失殆尽。二是抗原修复问题。由于免疫组化技术的发展，现在能在石蜡切片中显示的指标很广。相应地，除了优质的抗体外，我们也越来越依靠各种暴露或称修复抗原的方法，包括酶消化、热修

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问细胞免疫荧光图定量统计

Eason老歌迷

细胞免疫荧光或组织切片进行免疫荧光后，一个组织拍摄3-5个视野。统计时用的软件是可以用imagej 也可以用ipp6。

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问磁珠分选时，为什么不能用含钙镁离子的缓冲液

bamboopiggy

因为磁珠分选的buffer里面含有edta，如果用了含钙镁离子的缓冲液，会中和掉edta

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问请问流式检测膜蛋白表达的变化用多克隆抗体出结果的机会大吗？

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抗体只是针对相应抗原的，⾄于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并⽆明显影响，你只需要查清楚到底是针对哪⼀个部位的抗原的，应该是可以⽤同⼀种抗体进⾏检测的，在流式操作时只需注意：如果是针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原接触，否则就不需要了。

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问小鼠外周血进行流式细胞术鉴定细胞分型，为什么线性图看不到分群但是对数图可以？

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细胞分不开的因素有个人认为有以下因素（1）抗体的特异性不好（2）选的单标不合适，若细胞本身抗原就低表达，若还选择弱荧光的FITC那估计确实难以分开（3）前处理有问题，这点我自己感触很深，因为我刚做流式的时候单标抗体也分不开，后来经过好几次摸索才将细胞分开的，细胞一样，抗体也一样，就是前处理不一样。（4）仪器参数的设置，这个一般操作人员的技术比较高应该不会有多大问题，不过我们一般做的时候都会加一个同

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问PSA-NCAM，A2B5磁珠分别分选的什么细胞

冷泉港蛋白

1.说下PSA-NCAM:分离PSA-NCAM的阳性细胞，即细胞膜有该分子的细胞，比如Neural cells，厂家的阳性对照做的是该细胞厂家说明书（下图），你可以查下：2.如何查询这些信息：A.登陆数据库 UNIPROT 输入目的蛋白，找到expression.B.查询提供分离磁珠的厂家，说明书会有C.查文献

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问流式分选仪补偿怎么调整

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现在流式细胞仪都是自动调节荧光补偿，不过也要做好准备工作。如当我们同时检测四种荧光素FITC、PE、Per CP、APC，做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，FITC， PE， Per CP以及APC单染阳性的样本，这里需要一共5个管子。在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE， FITC-Per CP， FITC-APC， PE-Per CP，PE-

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问请问从人源PBMC中分选的T细胞亚群是需要现用现取吗？可否冻存或是否有稳定的细胞系呢？

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先从PBMC中分离得到淋巴细胞的混合物，然后用CD4+T细胞的单抗,免疫磁珠法分离；或者利用流式细胞仪进行分选。如果精确的话得用专门仪器了，要后续培养干扰小建议磁珠分，这个操作比较简单，对设备要求不高，如果是要纯度高推荐流式细胞术了，这个需要有分选的仪器，一般分析仪器只能分析比例。

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问请问多色免疫荧光这个技术如何？能够单独作为一篇文章的新技术亮点吗？

你好几和户

是亮点但也是难点，组织多色免疫荧光（mIHC），其染色分辨率更高，荧光信号强度更强、更稳定，并且不受抗体种属的限制，还是比较推荐的。

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问有的抗体在做IF时，效价很低，做wb时效价很高，说明书写明可以做IF和wb，种属也没问题，出现的原因？

whilt-shirt

这是抗体的原因，建议更换抗体试试

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问PE抗体无法标记，而FITC抗体的结果却很好，是什么原因?

bamboopiggy

说明是PE抗体有问题了，建议换抗体。

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问免疫组织化学的对照怎么设置

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做相关抗体预测实验，弄清楚抗体浓度，最好同时做抗体阳性和阴性对照

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问coip怎么区分抗体轻重链？

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在IP实验过程中，很容易产生IgG重链轻链的干扰，严重影响对结果的判断。那么，要想知道怎么样减少这些干扰呢，首先要理解这些干扰是怎么产生的。最好选择两个不同种源的抗体。选择同一种源的抗体的问题在于：在WB之前进行的蛋白变性这一步，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇，巯基乙醇会把抗体的重链和轻链之间的二硫键破坏，从而使的抗体变成重链分子55KD和轻链分子25KD。假设你IP的抗体是兔抗的，目的蛋白进行WB

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问细胞免疫荧光的假阳性

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在免疫检测中，比如 ELISA，CLIA 或者侧向流免疫检测中，嗜异抗体 (HA)，人抗鼠抗体 (HAMA) 和类风湿因子 (RH) 会通过与抗体的非特异性结合而降低检测的灵敏度和特异性，导致错误结果和诊断。因此，非常有必要使用专门的免疫阻断剂来降低这些干扰引起的假阳性结果，从而提高检测结果的准确性

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问做免疫荧光时没注意到加液体时吹起了气泡，做的片子也不太行，是气泡的原因吗？

Eason老歌迷

可能有气泡的原因!捞片时有气泡、切片有皱褶没展平等原因造成附贴不牢或附贴时切片下气泡过多都有可能导致结果不行。

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问第一次做免疫荧光，镜下观察只有 DAPI 的蓝光，目的荧光几乎没有，这是什么原因？

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出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度

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问人原代Tenon's囊成纤维细胞Vimentin染色

Eason老歌迷

染的很好看，谢谢分享啊，学习到了!

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