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科研学霸天团，48小时有问必答

问如何避免荧光素提前衰退？

丁香实验

1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。

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问如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？

丁香实验

产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分

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问组织免疫荧光染色必需用Triton吗

丁香实验

用丙酮固定细胞或是冰冻切片可以不许要破膜。丙酮本身就有改变细胞通透性和使蛋白沉淀的作用。——要看你做的蛋白存在于胞内还是胞外。胞外，一般是胞膜上的，可以不用Triton。胞内的，包括胞质内，胞核内的，那就得用了，不用的话，染到的阳性细胞只是其中的一部分。

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问切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

丁香实验

a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。

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问免疫组化结果老是出现阴性结果？

丁香实验

免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。你可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，你可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。

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问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

丁香实验

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.（3）现用现配，配好后4度避光保存。

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问在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

丁香实验

（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修复，我们一般用6miundefined4次，效果不错。

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问DAB显色时间如何把握？

丁香实验

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

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问中杉金桥的二步法免疫组化试剂盒要不要加封闭？液

boborsky

两步法不用加吧，我是用的dako的envision两步法，不用加血清封闭的。

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问石蜡切片免疫组化实验做不出结果是为什么？

苹果嘿嘿

最好把试剂和实验流程都列出来只这样说太笼统了

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问没有用盐酸分化有什么影响啊？

diudiu2006

盐酸分化只是将残留在胞质中苏木精洗掉，使胞质胞核的界限更加明显。与DAB上色没有关系。怀疑你的DAB显色没有成功。

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问免疫组化一抗的选择要点和技巧是什么？

xtt123

要点：一抗二抗都是一种可以特异结合别的东西的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）

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问组织切片做免疫荧光，背景色太重怎么办？

shy890726

背景色成因分两方面一、组织切片因染色过程或组织非特异荧光而出现的背景色二、拍照时因硬件设施或取景器设置而出现的背景色。针对第一种问题有以下几点建议：1. 采用高品质的多聚甲醛固定减少普通甲醛的自发萤光 2. 切片厚度减薄 3. 切片贴片后流水冲洗干净减少杂质荧光 4. 一抗以及二抗漂洗干净！（非常重要） 5. 选用高品质封片介质。针对第二种问题有以下几点建议：1. 曝光时间的控制 2. 暗室操

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问脱片产生的原因是什么？如何防止脱片？

口贝力15206

由于免疫组化过程长，组织切片长时间浸泡在缓冲液和试剂内经过多次冲洗浸泡和作用，尤其是在抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等因素的影响，极易造成脱片

4 回答6044 围观

问免疫组化结果与文献相反是为什么？

yqc127

这可能要从两方面考虑：1. 自己的主观原因，可能是自己实验操作的问题；如果自己的问题感觉不大，也可能是抗体特异性的问题，可以看看有没有相关的文献也用了类似的抗体，进而一步步查找问题。2.标本的客观问题，由于不知道有没有可能你的标本是一个有别于文献报道的特例？还是文献报道的情况是有限制范围的？这要自己斟酌。即使是同一样本，由于存在取材，保存，处理等多方面的差异也可能导致最终的结果的不同。

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问有人做过免疫组化，一抗用NF-KB么？求阳性结果图。

伊一1

可以查文献找图，有的公司网站上有对应抗体的图，还有就是找阳性对照组织做，最后建议你弄个阴性对照，就是用PBS代替一抗，这样更利于对比

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问细胞及组织标本的要求有什么？

鱼doctor

4%的多聚甲醛固定，不需要无菌，组织块大小最好是undefinedundefined0.15cm

4 回答7984 围观

问免疫组化一般如何设置对照组？

我是金博士

原则上讲，所有实验都应该设置阳性对照（用以检验染色过程成功），阴性对照（用以检验阳性结果为真阳性），空白对照（用以排除非特异背景染色）。不过，由于样本选取的复杂性，国内多数实验室以及国外多数小实验室，都无法做到规范的阴性对照，所以普遍以空白对照代替阴性对照，而这种方法也在国内外得到承认。

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问标准曲线怎么做不好?

冬天的棒棒糖

最好用排枪同时加显色液，样品浓度太高，都饱和了

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问为什么本应该是核阳却结果都是浆阳？

alaling

1. 请病理科大夫确认是否为假阳性。这个是非常关键的一步2. 如果确认为真阳性，那么请确认你的抗体是正确的抗体3. 如果上面两步没有问题，请相信自己的结果！可能别人的做法是做的其它组织的或正常肺组织而不是肺癌，不同组织表达位置不同；也有可能实际情况确实如此，再找原因进行分析！不要试图改变正确的结果附会其它人的结果，这样往往会导致真相被掩盖！

3 回答1854 围观

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