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        51bp的小片段酶连到我构建的pet30a spycatcher载体(5500多bp )中失败

        user-title

        dxy_dgd3c3o

        我是将我的一个51bp的小片段连接到我构建pet30a spycatcher载体(5500多bp )中,我连接了两次都有菌落长出,第一个就长了7个菌落,第二个板子上大约有15个左右的菌落,我菌p的两个板子都有与目的片段对应的菌落,然后我对这些菌落提质粒,在对质粒进行PCR,跑胶没有我的目的条带,这个是怎么回事?是我哪里出现了问题?要怎么解决

        1.我的51bp的小片段的PCR的跑胶结果特别亮,但是提的质粒PCR跑胶一点都没有

        2.我的双酶切载体的浓度为23ng/ul,我加了5ul,酶切后的目的基因浓度为3ng/ul,我加了2ul,我的酶连比例用的是1:4(大片段:目的基因),酶连温度时间:22度2小时,酶连总体系20ul,将全部酶连产物打入感受态当中,转化涂板

        3.我将双酶切的的pet30a spycatcher载体转化涂板,没有菌落长出,说明双酶切完全

        4.我也做了提出的质粒单酶切,以及质粒单独跑胶,单酶切在5000bp 左右有一个条带,质粒单独跑胶有三个条带

        谢谢各位🙏,目前实验处在瓶颈期,请求大家帮忙

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        2 个回答

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        你酶切之后小片段回收了么,我怀疑一个是没回收到,二是没连上,菌落pcr有时候并不准确,假阳性特别多

        user-title

        dxy_dgd3c3ouser-title

        我酶切之后的小片段用PCR清洁试剂盒清洁过,就直接用来酶连了,这个还需要再次跑胶回收吗?为什么菌落PCR假阳性那么多呢?

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        结合没有结合上,考虑调整引物或者增加连接酶。

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