WB上样量从18-60ug内参都非常浅（中性粒细胞）？

各位战友，我的实验出了点问题实在不知道是什么原因，求助各位帮忙看看。我培养两种原代细胞：中性粒细胞和单个核细胞，中性粒细胞比较脆弱提取出来后直接培养，单个核细胞经常是冻存起来再复苏培养。从外周血到提取出细胞约4-5小时，两种细胞均培养6小时后提蛋白做WB，中性粒细胞提蛋白加完细胞裂解液后非常粘稠，因为实验室没有超声破碎仪，所以用枪头反复抽吸或是加核酸酶，离心后中性粒细胞沉淀较多，取上清BCA测浓度后加裂解液和loading以定量定浓度，煮蛋白10分钟，然后分装-80℃保存，从加裂解液到分装冻存的时间大约1-1.5小时。我目前存在的问题有以下几个：

1、中性粒细胞提出的蛋白做WB内参很浅，尝试多次提取蛋白，上样量从18-60ug内参都很浅，部分目的蛋白做不出来，倍数增加上样量，但内参的条带并没有明显加深。这是为什么？但单个核细胞上样量10几内参就很粗（同样的内参抗体，稀释度一致），所以应该可以排除抗体的问题。两种细胞中性粒是提取出来后直接培养后提蛋白，而单个核细胞是冻存后复苏再培养提蛋白，除此之外，两种细胞各做操作完全一致。

2、内参做不齐，尝试了20多次，提取了很多次细胞，中性粒细胞就是怎么都做不齐，但是单个核细胞基本测完浓度上样就是齐的。

所以，1）是细胞活力的问题吗？中性粒细胞相对脆弱，但培养前和培养后均做过台盼蓝染色，死亡的细胞数并不多，而且收集细胞时低速离心，会把死亡的细胞离出去。且收集到的细胞沉淀多，测的浓度也不低，为什么内参就一直很浅，也怎么都做不齐？

2）还是因为裂解不充分，部分蛋白离心到了沉淀里？但上清蛋白测得的浓度不低。

另外，试过不同浓度的胶来跑，用12%的胶来做上样18ug，8%的胶上样50ug,反而是上样18ug的12%跑出来的条带更深一些，是因为两者曝光时间不一致的问题吗？

求求各位帮忙分析分析，实在想不出来到底是什么原因了