求助：WB条带背景太黑 是什么原因呀
搬砖狗啦啦啦
10%分离胶 5%浓缩胶
电泳 loading buffer 20微 marker 1微 蛋白20微
90V跑到marker分离出来 溴酚蓝大概在分离胶
接着换140V跑到溴酚蓝到最下面
转膜100min 350V NC膜
封闭 脱脂奶粉 2g+TBST40g 2h
剪膜 跑的是贝塔actin
一抗 4度摇床过夜 这次时间久了 大概21h
二抗 室温1.5h
学姐跑出来的都很好
和我的实验只有蛋白 配胶试剂和膜 抗体不一样
蛋白是自己提的 不知道含量
我用的配胶试剂是自己配的 学姐是碧云天试剂盒的
电泳液比较久 10✖️的至少几个月了
但是感觉电泳没啥问题
转膜液比较新 marker也转上了
抗体之前有老师说可以跑出来 但是是暑假前一个月
暑假一直4度保存
跑出来的条带 如图 背景太深
4 个回答
NatureBios
有帮助
这个现象考虑1 milk 完全溶解(超声一下除气) 延长封闭时间(或过夜) 2 清洗次数增加一次(注意ph值) 3优化一下一二抗浓度
土井挞克树
有帮助
一抗浓度过高，或者孵育时间过长。
秋秋欣欣
有帮助
可能是你的一抗，二抗抗体浓度太高
balalaLy
有帮助
marker转膜成功说明前面的步骤应该都没有问题，唯一不能确定的是你的蛋白有没有提取成功。另外，抗体4度保存一个月肯定不行了吧。你的实验从配胶的试剂到抗体都是有各种不确定性，作为新手菜鸟，这么操作你可能要走完所有的坑你才能做出比较漂亮的结果哦。建议你先借别人的可以用的蛋白和抗体跑一下。
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