19kd的蛋白跑WB出现的条带位置和形状不对
月夜踏马
各位战友，快急哭了，实验验证阶段，我跑的蛋白分子量是19kd，跑了好几次WB，曝光15-30s才能出现条带，条带的形状都很丑，而且位置在30-35kd之间。请问是什么问题？是杂带，还是胶的问题，还是抗体的问题？
我的条件是：12.5%雅酶的胶(最后一张图是10%的胶跑的)。
电泳液(1g SDS，3g Tris，14.4g甘氨酸)，电泳条件是先90V，等跑到分离胶并且marker跑开后转成120V跑到底。
转膜是90V转90分钟
5%牛奶封闭1-2h
一抗过夜(可达到12-15h)，一抗洗膜1小时，二抗孵育1-2小时，二抗洗膜2小时
4 个回答
郭郭求祥瑞
我也觉得胶有问题，但是下边没有目的条带，会不会是因为三明治结构没有那么紧，可以考虑多加一层白膜，我跑19kd的时候都是用的15%%的
月夜踏马
你好，那能麻烦你说一下你是怎么制胶的吗？我比对下，这两个多星期来跑的WB都是这个结果，很崩溃！谢谢！
我们实验室目前有用两种胶，一种是雅酶公司的，一种是诺唯赞公司的，我最近在用12.5的胶，配置方法：分离胶配法是8ml下层胶溶液+8ml下层胶缓冲液+160ul促凝剂，浓缩胶的配法是3ml上层胶溶液+3ml上层胶缓冲液+60ul促凝剂。(多配的，实际制胶的时候会剩一点)
土井挞克树
看着像胶的问题，一般微笑影和胶或者电泳槽偏离有关
麻黄连翘赤小豆
可能是胶的问题，还有蛋白是不是有点降解了，电泳的时候不能跑太快
月夜踏马
应该不是蛋白降解的问题，我都是用的新提的蛋白，而且两个批次的蛋白都这样。
电泳的速度是先90V，到分离胶后Marker跑开，我调成120V。
12.5的胶跑到下面的时候，会发现25、15和10的指示剂条带高度很宽，甚至有点弥散的样子。然后转膜之后就可以看到PVDF膜上有色素残留，尤其是15kd-25kd的位置比较明显，且每个泳道都有色素残留。
这种现象并非偶然一次。
谢谢回答！
申东熙老伯
条带这个形状显然跑胶的时候就有问题，你的电泳槽下面是不是锈了，以及既然条带小，就不要电泳太久，和预计条带大小有区别很正常。
月夜踏马
感谢你的解答。我们实验室目前有用两种胶，一种是雅酶公司的，一种是诺唯赞公司的，我最近也都在用12.5的胶，配置方法：分离胶配法是8ml下层胶溶液+8ml下层胶缓冲液+160ul促凝剂，浓缩胶的配法是3ml上层胶溶液+3ml上层胶缓冲液+60ul促凝剂。(多配的，实际制胶的时候会剩一点)
而且每次转膜结束，我会发现膜上会残留一部分色素，粉红色的那种，越靠下越明显。
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