WB实验内参经常性出现不齐，重新定量后也会有同样的情况，怎么解决？

每次上样前可以试一下把蛋白摇一下，长时间冻融可能会导致管子里面蛋白不均匀

下一次加样的时候根据上一次的结果自己调整一下上样量看看

内参在蛋白提取过程中发生不同程度的丢失，会导致WB检测时内参不齐，定量只能定蛋白总量，当蛋白发生丢失后比例发生变化，虽然等蛋白量上样，但是内参依然不齐。提取总蛋白可以尝试用柱式法总蛋白提取，这样可以避免蛋白丢失引起的内参不齐

读取内参的灰度值,然后根据灰度值进行调整

BCA定的总蛋白量，不是内参的量，一般是根据初次WB结果的内参灰度值校准内参

你的这个问题是非常常见的，就算在实验室专业做WESTERN的人员，也会遇到内参不齐的问题。单独上样可以出现，可以排除蛋白本身的问题，但混合一起加时却跑的不齐，最大的可能就是胶的问题，胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。还有就是抗体孵育问题，不知你是用孵育盒，还是用封膜孵育，一定要保证膜与抗体充分接触，保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的，注意混合比例，祝楼主早日跑出理想的条带。