样品-80度保存，7天前做过条带有 前天再做条带很模糊，怀疑一抗失效把显过影的这张膜敷了一次新配的一抗还模糊 一直用预制胶。为啥

虽说反复冻融蛋白会降解，但经验证明冻融个4，5次是没有多少影响的。所以你的这个应该不是样品的问题，抗体和预制胶的问题比较大。预制胶虽然是商品化的，但是也不是万无一失的。要敢于质疑

是不是电泳液的问题我们使用的电泳缓冲液一般用三次就换了，用到后来对电泳的速度影响很大，电泳跑的很慢。或者是你的胶相机没有调整好焦距?

1.样品坏了，2，转膜有问题，感觉转膜有问题的概率高

可能是反复冻融导致蛋白有些降解