救救，WB苦手又来了，几乎所有条带都这样，没有蛋白，背景脏~
小菠萝头吖
友友们，这个是蛋白降解的问题还是抗体的问题，还是封闭的问题呀，老是出幺蛾子，真的累觉不爱。。
蛋白提取了之后分装在-20 但是有一个月了。
电泳90V 30min，130V 45min转膜半干转25V 30min 一直是这个条件，之前都起码能跑出内参的。
封闭液是快速封闭液，但是也是回收过，放在冰箱时间有点久了，大概有2-3个月了，所以本来15分钟就好封闭了，这次封闭了30分钟
洗膜就和平常一样。。
3 个回答
天一湖医者
有帮助
背景脏不一定是因为仪器不干净造成的，也有可能是蛋白降解或者整个实验过程中条件不合适造成的。
丁香清香
有帮助
WB背景高可能的原因及建议：
①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。
②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。
③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。
④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。
⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。
⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。
balalaLy
有帮助
一个月蛋白降解不会那么夸张连一点蛋白都没有，应该是转膜的问题，条带上还有个很明显的空泡
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
提问
扫一扫
实验小助手
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序