如何保证GFP嵌合体监控蛋白质和蛋白质相互实验完整进行

可以选用非变性聚丙稀醜胺凝胶试剂

我理解是双分子荧光系统检测蛋白相互作用吧？有以下几个问题要注意：

1、荧光信号较弱

原因：蛋白空间位阻所导致的片段间不能相互靠近

对策：荧光片段和目标蛋白之间最好加一个连接肽。

常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT,RPACKIPNDLKQKVMNH和GGGGS等

2、实验温度不当

原因：温度对片段间互补影响很大

对策1：在室温或低于室温（≤）下培养细菌或细胞

对策2：在生理条件下培养细菌或细胞，使融合蛋白正常表达，然后将培养物低温处理1至2h或接着室温培养1d

3、不能明确蛋白之间的相互反应

原因：没有明确的阴性对照

对策：建立阴性对照。以便更加确信BiFC信号反映的是蛋白质之间的相互作用

4、转染效率低

原因：所使用DNA的启动子不能被待转染细胞所识别

对策：在转染实验前，请确认所转染DNA确实能在待转染细胞内表达

5、没有生成高效率的DNA-转染试剂复合物

原因：在制备生成DNA-转染试剂复合物时，使用了含有血清的产品

对策：转染复合物必须在无血清中形成

6、细胞毒性大

原因1：DNA用量太大

对策1：建议绘制量效关系曲线来确定最佳的DNA用量

原因2：细胞密度太低

对策2：转染DNA时，建议细胞密度控制在~70%左右，细胞密度太低可导致转染过程中细胞毒性增加

原因3：稳定转染时抗生素加入时机太早

对策3：在转染48h后加入选择用抗生素

7、转染效果不稳定，不能重现

原因：转染时细胞密度没有控制的较为均一，差异太大

对策：务必使每一次转染时细胞的密度较为均一。推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降

8、转染试剂有时呈云雾状浑浊

原因：转染试剂储存温度太低

对策：请务必不要低温保存转染试剂，+4℃环境即可；如果将转染试剂误放在-20℃以下环境，建议将冰冻的转染试剂(LipoD293™和LipoJet™转染试剂除外)温浴10min后，待完全融化后，再进行转染操作。

9、转染复合物出现沉淀

原因：有过量的EDTA存在

对策：将DNA溶于纯水而不是TE缓冲液