内参不显影，或者曝光30分钟才可见模糊的显影，请问是什么原因呢？

我最近做western blot目的蛋白（幼年大鼠原代心肌细胞kir3.1蛋白，56kd，santa cruz抗体sc-50410，1：800稀释）条带清晰，曝光30s显影就很好了，但内参（β-actin，43kd，中杉TA-09抗体，1：200稀释）不显影，或者曝光30分钟才可见模糊的显影，请问是什么原因呢？其它条件：12%分离胶，90v湿转100分钟，目的蛋白5%脱脂奶粉4度封闭过夜，第二天室温封闭2h，一抗孵育2h，内参5%脱脂奶粉室温封闭2h后一抗4度孵育过夜（也试过封闭过夜），第二天室温孵育2h，二抗分别为中杉金桥的抗兔和抗小鼠抗体，均为1：2500稀释，室温孵育1h。 试过很多次，marker跑得很开，从55kd-40kd间隙上1/3处切胶，actin应该不会切丢，请问老师问题可能在哪呢？