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科研学霸天团，48小时有问必答

问WB 的试剂准备应该自己配制还是买试剂盒？能给点建议吗？

momimimimomi

做WB实验比较花钱的是一抗，国外进口的1支大概在3000元-5000元之间不等（根据你的指标而定），二抗价格相对便宜很多，如果使用荧光二抗的话，1瓶Dylight 2000元的可以使很久。剩下的试剂均可以单独购买，Marker、蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白抑制剂最好买进口的，价格可能在1000元-3000元左右（根据公司、规格），剩下买国产的即可，如裂解液、电泳液、电转液、Tris-Hcl、SDS-P

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问从大鼠股骨中用液氮研磨后提取蛋白也是跟常规的组织提取蛋白用的试剂一样吗？

南瓜先生86

如果是提取核蛋白还需要加提取核蛋白的裂解液

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问做 Western 的时候，上样时等体积或者等质量上样有什么区别呢？

liudong150

应该都是等质量上样吧，挑成等体积的话跑出来条带会好看一些，个人意见。

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问beta-actin条带灰度一致，但是宽度不一致？

我是金博士

说明上样量不均匀。

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问水通道蛋白如何提取呢？

塞舌尔墨宝

提取总蛋白，上样检测，利用特异性抗体就可以把你需要观察的对象区别出来

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问双向电泳跑不好啊怎么办？

phhcrab

这个实验比较复杂，要做得好有难度，特别是大胶。样品制备是关键，后续的操作也很重要。试剂尽量用好一点的，不要省这个钱。多向做过的前辈取经，还有可以咨询设备厂家（GE或Bio-Rad）的技术支持。

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问我做了好几次 WB，为什么不是什么条带都没有，就是一片漆黑？

我是橙子橙

一片空白的情况下只有Maker条带

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问为什么小分子没有转到膜上？

三儿的脚麻了

如果觉得自己的操作没有问题的话，我估计就是实验条件的问题。每次我转膜都是用的恒压，你可以尝试改变一下你的实验条件。比如：电压或者电流（但是那要取决于你是恒压还是恒流）。一点愚见！嘿嘿！加油！

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问western blot 可以同时加两种以上的一抗吗？

tao0129

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

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问蛋白放入-80之前还需要加蛋白酶抑制剂吗？

我是金博士

装冻存，避免反复冻融，尽快检测。不用加蛋白酶抑制剂

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问蛋白电泳中途不给力了怎么办？

tao0129

1. 如果sample 先跑的动，后来就不动了，很可能就是缓冲液的问题，这时候单纯的提高电压是没用的。2. pharmacia 系统跑的时候可以清楚的看到电极丝上面有气泡形成，电压越高气泡越多。有气泡但是sample就是不动，那一定就是缓冲液问题。3. 检查缓冲液的时候，从配胶缓冲液开始查起，有些新同学在配胶的时候可能就是吧浓缩胶缓冲液和分离胶缓冲液弄混了。4. 另外，电泳缓冲液最好是用前现配，尤

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问蛋白质粉碎

丁香通采购助手

如果要破碎细胞的，现在都是用超声波细胞破碎仪吧

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问sds-page

我是金博士

煮过就没有问题了，已经变性了呀

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问提蛋白时将同组标本随机两两混合了，即（2con：2处理）。请问这样可以吗？

我是金博士

1、你为啥要这么写在文章中呢。。。2、这样做当然是可以的 3、别人的文献中肯定不会这些写撒

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问从细胞提蛋白，浓度总是不高？

我是金博士

跑电泳染胶看看结果图可以放上来Bradford对很多东西比较敏感，比如urea

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问在 WB 实验中，使用 TBS 和 PBS 的区别？

赵栋2012

选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在pH7.0 以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。

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问蛋白样本能保存多久？

我是金博士

可以的，已经变性了，所以可以放置很长时间，不过要注意一下标记，长时间保存，保存的记号容易变淡，这点注意一下就好了，还会实验条件之类的。

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问WB 实验为什么会出现无目的条带？

我是金博士

膜上无蛋白，可能样品降解或者上样量太少了

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问Western Blot 那种染色好？各有什么特点？

赵栋2012

zyffzw战友回答：1.阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5 μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。2.胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。3.生物素化灵敏度位于1~3之间

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问如何提取酵母菌的蛋白质？

我是金博士

可以用一步法酵母活性蛋白提取试剂盒。由于酵母有坚硬的细胞壁，传统的提取采用强碱，使得大多数蛋白产生变性，而玻璃珠法蛋白提取会使得玻璃珠对蛋白产生一定的非特异性吸附作用，导致蛋白质的损失，该一步法酵母蛋白提取试剂采用一种温和型的非离子去污试剂在20分钟内从酵母细胞中提取可溶型蛋白，而且大决数蛋白可以保持活性，通过对毕赤酵母的可溶型蛋白提取表明，该方法提取效率要高于传统的玻璃珠法。本试剂盒可以使用20

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