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科研学霸天团,48小时有问必答
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做WB时一抗洗完一定要马上敷二抗吗?
府宅
要立马敷二抗,如果不洗,一抗可以过夜,但洗完之后就要马上敷二抗,要不会影响结果
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问
免疫共沉淀coip中的同型对照怎么选
洛噜啦噜啦嘞
免疫共沉淀coip中,建议以2a为主。
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问
如何选择表达出蛋白的WB抗体?
科拜余萌
WB实验中使用到的有三种抗体:一抗、二抗和内参抗体。一抗是唯一针对目标抗原的抗体,可以进行制备也可以购买现货,难度系数较高;二抗直接买就OK,只是需要留意下种属选择;内参抗体必不可少,是WB实验中的质控环节。 WB检测之一抗 一抗制备 如果目的蛋白的现货抗体没有找到,或者都不中意,就需要亲自动手制备了,请公司帮你做也不错哦!自己制备一抗通常情况下可以选小鼠、兔制备多抗或者选小鼠制备单抗,前者省时省
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问
MS1和MS2两个谱图的区别有哪些
天一湖医者
MS1信息的准确性,取决于很多因素,比如色谱的喷雾足够稳定、样品的纯净度高,严格控制污染等等,这些条件都满足了,才能得到比较完美的一级定量信息,这对后续的定性定量分析都会有帮助。样品的前处理和质谱的维护这两个关键的因素,一定要把握好,如果有影响,那么在后续的数据分析中,任何统计方法搜库方法都无法挽回先前的污染信息。MS2简单讲就是将一条完整肽段送入质谱进行打碎之后得到的信息。我们的碎裂过程一般来说
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问
PPAR gamma主要在哪表达
未来9
在啮齿类动物中,PPARγ 主要在脂肪组织中表达,而在人体,除脂肪 组织外,在巨噬细胞以及其他脂肪贮存细胞,如肝、肾、肺及直肠中均有表达
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问
植物中看一个磷酸化酶对下游基因是稳定还是降解,如何看上样量是一样的
bamboopiggy
植物应该也有内参吧?只要内参齐就可以啊,然后看你目的蛋白改变的趋势
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问
RUNX2WB检测中实际检测条带与预测不符
bamboopiggy
看抗体说明书,好多蛋白都与预测位置有差异,先看说明书,不行跑全膜,只要有趋势就可以
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问
RUNX2和PGC1 alpha在WB检测中
bamboopiggy
1.确定蛋白没降解。2.找个阳参,确定抗体好使
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问
原核纯化蛋白,IP纯化后的目的带比破碎后的上清的带弱,是什么原因
天一湖医者
是否考虑上样量过小 ,可增加上样量、降低一抗稀释度并延长曝光时间
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问
Pull-down对照组也能拉下来条带,是什么原因?
dxy_gwrp7ndq
反应的sample浓度不是越高越好,会造成洗脱困难,造成这样
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问
酵母双杂交实验过程中,是否需要用到内切酶,有要求吗
迟C迟
构载体的时候可能需要限制性核酸内切酶把目的基因连入目的载体。转入酵母菌之后就按正常的protocol,后面就不需要内切酶啦。
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问
跑蛋白的时候一定要复温吗
liuyuqiang886
不用,只要解冻后混匀即可。亲试做了好多年没有复温,结果很好!
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问
跑蛋白时候可以用移液枪加样吗
dxy_gudflck7
肯定可以啦,用10微升或者20微升的移液枪都可以的,枪头尖尖伸到胶孔上缘就可以点啦
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问
奶粉在wb中起到什么作用用别的什么代替呢?
府宅
BSA成分单一,是常用的封闭试剂,二抗稀释液中不含有BSA或者脱脂奶粉血清等,可能会导致二抗与之结合,降低二抗的结合力。
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问
跑wb时候电压用多少v比较好 什么时候变
未来9
电压条件 我们经常用的浓缩时80V,分离时100V比较好,条带很平
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问
目标蛋白和内参要在一张膜上曝光吗?
府宅
可以分开曝光,这样的话可以避免以为两张膜因为荧光的强弱差别太大导致曝光时间顾此失彼,根据你的情况你可以将蛋白上样跑胶后,根据marker将目的蛋白和内参分开切下来,并用不同时间或条件分别转膜后在曝光,这样的话就可以进行比较了。
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问
请问跑wb时候你们用PVDF膜还是NC膜 有什么区别
天一湖医者
硝酸纤维素(NC)膜与蛋白质之间靠疏水作用结合,无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅;价格低廉,使用方便。但结合在NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失;NC韧性较差,易损坏。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜与蛋白质亲和力高,用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电荷蛋白结合。根据被转移的蛋白分子量大小,选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白
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问
LC3B的WB实验中,出现LC3B1 LC3B2两个条带,一般是使用LC3B2/1还是LC3B2与housekeeping蛋白比
天一湖医者
如果连内参都出现两条带,且彼此很接近,就要考虑是否是蛋白样本降解了;这是一般考虑使用LC3B2/1。
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问
噬盐菌光合磷酸化为什么不能代替复杂低效的光合磷酸化?
洛噜啦噜啦嘞
嗜盐菌紫膜的光合作用是迄今为止所发现的最简单的光合磷酸化反应嗜盐菌的菌视紫素和光介导 (Light-mediated)ATP 合成系统:在厌氧光照条件下培养嗜盐菌时,产生一种菌视紫素嵌入细胞质膜中,成为紫膜,使菌体呈现红紫色.紫膜的膜片约占全膜的50%,由 25%的脂类和75%的蛋白质组成.这种蛋白质与动物视觉器官的感光细胞中的视紫红质(rhodopsin)相似,也含有视紫素,被称为菌视紫素.嗜盐
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问
WB条带形状是圆形不是条形怎么办
bamboopiggy
如果有趋势,可以直接用,没事,估计是你胶灌的不匀
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