求助碧云天RNA nase使用小技巧

很有可能是rna提的不够纯导致的

RNase R消化一般于37℃进行反应，时间10-30 min为宜（Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017），不推荐过长时间的消化。另外检测不同的基因可能也需要摸索反应时间，笔者实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果，线性基因丰度可以降低几十到几百倍，circRNA丰度则基本不变。

经RNase R消化后直接进行逆转录反应的，推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活（Cheng ZF et al., 2002）。如果消化后要进行纯化回收，也可以不做酶的失活。

在处理CirCRNA（环状RNA）的RNase R消化实验时，确保操作的准确性是非常关键的。以下是一些可能有帮助的窍门和建议：

1. 反应时间和温度：RNase R的反应时间和温度是非常关键的参数，需要根据你的样本和实验设计进行调整。过长的反应时间或过高的温度可能会导致过度消化，包括目标CirCRNA。

2. 酶的量：确保你正在使用正确的RNase R量。使用过量的酶可能导致目标RNA被消化。

3. RNA的纯度和完整性：在RNase R处理之前，确保你的RNA样本是纯净和完整的。RNA样本中的蛋白质、脱氧核糖核酸（DNA）或其他杂质可能影响RNase R的活性。

4. 样本量：在RNase R消化实验中，输入的RNA量可能会影响消化效率。你可能需要优化你的实验条件以确保你有足够的RNA进行后续的分析。

5. DNase处理：在RNase R处理之前，进行DNase处理以去除可能存在的DNA杂质。

6. 消化后清洗：消化后要彻底清洗，否则可能会有RNase R残留，影响后续PCR实验。

7. 验证CirCRNA：可以使用Northern blot或其他方法验证CirCRNA的存在，此外也可以设计跨过回接处的引物进行PCR以验证CirCRNA的存在。