• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        miRNA靶基因验证,双荧光素酶报告基因实验

        相关实验:用T4 RNA 连接酶连接 RNA 分子

        user-title

        尛哲先森

        miRNA靶基因验证,双荧光素酶报告基因实验

        实验分组说明:

        miRNA(目的miRNA)

        miRNA-NC(阴性对照)

        pmir-GLO(报告质粒空载)

        pmir-WT(加了含靶基因结合位点的3'UTR片段)

        结果:

        miRNA能显著降低pmir-WT的荧光素活性,符合预期。然而,miR-NC也能使得pmir-WT的荧光素活性下降,此处百思不得其解。

        难道是加上去的序列片段能直接影响质粒上荧光素酶活性?

        更改3'UTR长度重新构建报告质粒,结果还是一样。

        又进行实验,更换转染试剂进行对比,更换双荧光素酶检测盒子进行对比,结果均得到miR-NC也能使得pmir-WT的荧光素活性下降。

        有没有友友遇到同样情况的,请教一下怎么处理才行图片描述

        图片描述

        wx-share
        分享

        3 个回答

        user-title

        啦啦啦FCB7

        有帮助

        我也是,目前还没有找到解决方法

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        加上的序列片段会通过表达影响的荧光素酶活性。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        这种情况可能是由于报告质粒pmir-WT本身存在结合其他蛋白质或RNA的结构,导致其荧光素活性受到影响。也有可能是miR-NC具有一定的非特异性作用,与pmir-WT中的其他序列结合导致其荧光素活性下降。

        为了确定问题的原因,可以尝试进行以下实验或措施:

        使用不同的靶基因结合位点,验证miR-NC是否也会对其荧光素活性产生影响。如果是,则可以考虑更换报告质粒或靶基因结合位点的设计。

        对pmir-WT进行序列分析,确定是否存在其他可能的结合靶点,从而确定miR-NC是否与这些靶点发生相互作用。

        对pmir-WT进行mutant构建,将靶基因结合位点进行变异,观察miR-NC对其荧光素活性的影响是否减弱或消失。

        鉴定报告质粒是否存在其他问题,例如插入序列长度、序列方向、序列完整性等等。

        考虑使用其他检测方法进行验证,例如RNA干扰、西方印迹等方法,以确定miR-NC对靶基因的影响。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序