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        2811bp序列pcr扩不出来?

        相关实验:RNA 的提取和纯化实验

        user-title

        dxy_popcct76

        如上所述,我的目的基因长度是2811,在甘蓝里面扩增,与细胞壁合成的纤维素酶有关,之前已经试出体系,25ul,2-2-2,退火温度是64,目的基因已经提取完成,等待下一步和载体连接,因为有事实验搁置了 ,再回来做基因降解了,冲只能重新回收, 然后现在一直跑不出条带,很多条件都试了,但还是没有条带无法回收,有条带的也是极淡。

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        4 个回答

        user-title

        sswei

        有帮助

        1.重新设计扩增引物,提高引物特异性

        2.设计两对引物,进行巢式PCR

        user-title

        小小翻车鱼

        有帮助

        关于您提到的2811 bp序列扩增不出的问题,以下是一些建议和方法,您可以尝试调整这些方面以提高扩增效率:


        1. 引物设计与优化:检查引物设计,确保引物长度、GC含量、特异性和引物间距离都合适。同时,确保引物没有形成二聚体。可以尝试重新设计引物,或采用软件如Primer3等进行引物优化。


        2. 模板量:增加模板DNA的量。较低的模板量可能导致扩增效率降低。尝试增加模板DNA至50-100 ng。


        3. PCR反应条件:尝试调整退火温度。虽然已经设置了64℃的退火温度,但2811 bp的序列可能需要更低的退火温度。可以从55℃开始尝试,逐步降低至理想温度。同时,优化循环数、延伸时间以及循环中的退火时间。


        4. 聚合酶:更换聚合酶。不同的聚合酶可能对不同序列的扩增效率有所不同,可以尝试使用其他类型的聚合酶,如高保真聚合酶或热稳定性强的聚合酶。


        5. Mg2+浓度:调整Mg2+浓度。Mg2+浓度对PCR扩增效率有很大影响。可以尝试从1.5 mM开始,逐步增加至2.5 mM,找到最佳Mg2+浓度。


        6. 巢式PCR:如果以上方法均无效,可以尝试进行巢式PCR。通过设计两对引物,分别在两轮PCR中扩增目标序列,可以提高扩增效率。


        7. 溶解DNA模板:确保在提取DNA时,模板已经完全溶解。不充分的溶解可能导致扩增效率降低。


        尝试以上建议后,若仍然无法成功扩增,可能需要重新考虑提取和纯化DNA的方法,确保提取出高质量的模板DNA。同时,也可以重新设计引物,以获得更好的扩增效率。

        user-title

        粥辰辰辰辰

        有帮助

        如果引物特异性比较高,模板比较纯的话产物也是一样的,如果担心有其他的片段,可以用第一次pcr产物稀释后作为模板继续pcr,这样就能得道比较纯的产物了.

        user-title

        此用户已注销

        有帮助

        1. 扩增条件非最佳;

        2. 样本中含有抑制扩增的物质,如乙醇。

        一对引物有其特定的 Tm 值,但 Tm 值时未必是其最佳扩增温度。温度过高时,扩增效率过低,差异部分的目的基因不能被扩增,导致「假阴性」结果的出现。那么,如何确定扩增效率是否满足要求呢?

        通常,拿到新引物后应从 Tm- 5℃ 寻找其适宜的扩增温度,在某温度起为特异性扩增。

        然后,在特异性扩增的温度下检测扩增效率:将 cDNA 梯度稀释(一般为 2×),测试稀释后的样本 Ct 值差异是否为 1 左右。

        1、若差值为 1,则扩增效率良好,可进行正式实验。

        2、若在特异性扩增的温度范围内不能使 Ct 值差异为 1,则需考虑重新设计引物

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