• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        M13引物菌液PCR鉴定同一重组质粒的不同单菌落出现大小不一的条带是什么情况?

        相关实验:🔥 菌液 PCR

        user-title

        西山人质WXL

        重组质粒通过同源臂连接,挑取8个单克隆,过夜摇菌后使用M13引物(载体上位于目的片段两端)进行菌P,条带都很单一,但结果有4个菌落条带较高,有4个较低,大概相差100-300bp左右(8个条带均位于1000-2000之间),我的目的条带大概1350bp,空载体扩增结果条带大小应该在300bp左右,我比对了一下我的序列和载体序列以及同源臂和引物,均没有问题,请问这种情况是什么原因造成的?

        wx-share
        分享

        3 个回答

        user-title

        沫子大大

        有帮助

        模板DNA的浓度可能会影响扩增产物的大小,
        但不同克隆在PCR反应条件上可能存在差异,如退火温度、延伸时间、引物浓度等。这些差异都可能导致扩增产物的大小存在差异。克隆体中可能存在着突变,这些突变可能会影响PCR扩增的结果。如果重组质粒存在染色体DNA污染,那么PCR扩增的产物大小也可能存在差异。

        user-title

        dxy_mqg1dtg8

        有帮助

        这种情况可能是由于PCR扩增反应中模板DNA的数量不同或PCR扩增条件不一致导致的。

        可能的原因包括:

        1. 模板DNA的数量不同:不同单克隆中模板DNA的数量可能存在差异,如有些单克隆中模板DNA浓度较高,而有些单克隆中模板DNA浓度较低,会导致PCR扩增反应中所用的模板DNA数量不一致,从而影响扩增产物数量和大小。

        2. PCR扩增条件不一致:如反应温度、时间、引物浓度、酶浓度等条件不同,会导致PCR反应的特异性和效率不同,从而影响扩增产物的数量和大小。

        针对这种情况,可以尝试以下措施来解决:

        1. 调整PCR反应体系:如使用同样的反应体系,控制好PCR反应条件的一致性,尽量减小扩增反应中模板DNA数量和PCR条件对扩增产物的影响。

        2. 优化PCR扩增条件:如调整反应温度、时间、引物浓度、酶浓度等条件,以提高PCR反应的特异性和效率,减少PCR扩增过程中的误差。

        3. 扩增多个单克隆:扩增多个单克隆,筛选出产物最纯净、大小最接近目的片段的单克隆进行后续实验。

        4. 对扩增产物进行纯化和测序:对扩增产物进行纯化和测序,以确定扩增产物的大小和序列是否符合预期,进一步排除其他可能的影响因素。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        可能的原因包括:

        1. 混合物问题:在挑取单克隆之前,可能存在混合物中的不同克隆,导致你观察到多个条带。这可能发生在转化或挑取单克隆的过程中。

        2. 重组事件多样性:同源臂连接可能会导致多种不同的重组事件发生,包括插入、缺失或其他改变。这些事件可能导致了不同大小的条带。

        3. 重组位置:同源臂连接的位置可能会对重组产物的大小产生影响。某些位置可能更容易产生较大或较小的条带。

        4. 载体结构变化:重组事件可能导致载体的结构变化,例如重组片段的重复序列或其他插入物可能导致不同大小的条带。


        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序