🔥 乳酸菌菌液 PCR

 不必提取目的基因 DNA，不必酶切鉴定，直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增与鉴定。

常用于检测菌落是否携带目标质粒。

（1）菌种的分离和纯化：采用 MRS 培养基对样品平板划线法进行分离培养，培养后挑选单个菌落在 MRS 固体培养基上进行反复多次划线培养，镜检直至看到单形态的纯菌种。

（2）实验前准备：从 MRS 固体平板上挑取单菌落，重悬于 300 μL MRS 液体培养基中，于 37 ℃，180 r/min 摇床上培养 3~4 h。

（3）加样：根据 Taq 酶试剂说明，在冰上配置 PCR 体系，向 PCR 中分别加入去离子水、2 × Taq Mix、引物。接来下操作置于超净台上，在超净台中最后加入菌液模板。反应体系（25 μL）为：2 × Taq Mix 12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，菌液 2 μL，ddH₂O 9.5 μL。同时设置阴性对照，阴性对照中模板为灭菌 ddH2O。

（4）PCR 反应：将含有 PCR 反应液的 PCR 管放入 PCR 仪中，根据酶的使用说明，设置反应条件，进行 PCR 反应。常规反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保温。反应结束后，将 PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察目的条带并拍照。

（5）测序：将符合目的条带大小的结果阳性的菌液送去测序，确定目标序列的存在和鉴定乳酸菌类型。

（1）挑菌：加菌液模板时需在超净台中进行，防止挑取的单菌落污染其他杂菌。

（2）PCR 加样操作：EP 管和枪头等耗材要先进行高压蒸汽灭菌，去除 DNA 酶（无酶无菌耗材除外）。

（3）PCR 反应体系：反应体系的组成必须准确无误，反应体系中的每种组分的浓度必须严格控制，避免产生不必要的影响。

（4）引物设计：引物的设计必须准确无误，避免引物的特异性不足或者引物的二聚体形成导致的扩增效率低下。

（5）PCR 反应条件：PCR 反应条件包括温度、时间、酶浓度等，需要严格控制以确保 PCR 反应的准确性和稳定性。

（6）PCR 反应质量控制：PCR 反应后，需要进行质量控制，如电泳检测 PCR 产物的大小和数量，确保 PCR 反应结果的准确性和可靠性。

（1）出现非特异性放大：可能是 PCR 反应体系中反应条件不合适，如温度、时间、酶浓度等。也可能是引物设计不合理，需要重新设计引物。

（2）PCR 反应无放大：可能是样品中的 DNA 浓度过低，需要提高 DNA 的浓度，可通过延长菌液培养时间或增加菌液模板量解决。也可能是 PCR 反应体系中反应条件不合适，需要重新调整反应条件。

（3）PCR 产物不稳定：可能是 PCR 反应体系中存在抑制因素，如杂质或其他抑制因子，需要对反应体系进行优化。

（5）PCR 重复性差：可能是样品处理、反应体系或 PCR 仪器本身的问题，需要检查并解决问题。

（6）扩增产物出现多条带：可能是挑取单菌落的时候沾到多个菌，或者是反应过程中污染了外源 DNA，需要注意严格挑取单菌落，和反应过程中的无菌操作。