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        同源重组克隆时序列GC含量过高,一直连不进去,有什么办法可以改善这个问题吗?

        相关实验:同源一步荧光等位基因特异性PCR

        user-title

        dxy_fdcloby8

        如题,看到有推荐使用GC buffer的,但是同源重组又不是pcr,这个方法有人做出来过吗?或者有什么别的方法吗?

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        3 个回答

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        使用GC buffer我们实验室有人搞出来的

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        以下是一些建议可以帮助您改善这个问题:

        1. GC buffer:GC buffer是一种用于增加PCR成功率的缓冲液,可以在PCR反应中帮助解决高GC含量的序列难题。虽然同源重组不是PCR,但尝试在同源重组反应中添加适量的GC buffer,可能会有所帮助。您可以尝试使用低浓度的GC buffer,并在实验中逐渐优化其用量。

        2. 优化酶和缓冲液:尝试使用具有高GC容忍性的DNA聚合酶和相应的缓冲液。某些商业化的聚合酶和缓冲液配套可以提供更好的适应高GC含量序列的能力。

        3. 引物设计:重新设计引物,以便在目标序列中使用较低的GC含量区域作为引物结合位点。您可以使用引物设计软件来优化引物的设计,并确保引物与目标序列的高GC区域的互补性较好。

        4. 引物热解性能:优化引物的热解性能,确保引物在反应过程中能够充分解离。这可以通过调整引物的长度和热解温度来实现。

        5. 分段克隆:如果整个序列都难以克隆,可以考虑将目标序列进行分段克隆。通过将序列划分为较短的片段,可以降低每个片段的GC含量,从而提高克隆的成功率。

        6. 尝试其他克隆方法:如果同源重组仍然无法解决问题,您可以尝试其他克隆方法,如转座子介导的克隆、Gateway克隆或其他适用于高GC含量序列的克隆技术。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        同源重组也可以使用GC buffer,可以辅助克隆连接

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