一个疑问：熔解曲线有 2 个或 2 个以上的峰如何解决

是不是引物二聚体，你做个阴性对照（只加引物，不加模板）就知道了。不过看峰的位置，是非特异的扩增，与你的引物或者cDNA有关，你已经试过了多种退火温度都没有改善，说明它影响不大。

1采用两步法，适当提高退火温度

2引物10uM,20ul的体系加0.5ul

3模板梯度稀释的时候不要1+9ul这样稀释，扩大体积比如20+180ul

较为理想的熔解曲线是单峰曲线，如出现多峰有以下原因：

1）非特异性扩增：主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高，可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度 PCR 对引物退火温度（Tm值）进行优化，上调Tm值，选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂，提高核酸提取质量，等等。

2）引物二聚体 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请按照以下方面进行优化：

A.优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由 95℃变性步骤直接进入 60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60℃。

B.引物浓度太高，适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200 nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。

C.cDNA模板带有基因组DNA污染：重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理，然后逆转录为cDNA。

如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况，就要考虑及时更换试剂盒，避免耽误实验进度

可以考虑重新设置基线，然后排除一下体系降解。

溶解曲线如果不是单一峰的话，最好重新设计引物

重新设计新的引物吧，这个不能用了

有可能是引物特异性不好，或者是你的目的片段有多拷贝/同源序列。