实验问答22,612,335 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

PCR

问克隆时发生突变了怎么办？

zhongmindai

回复突变可以用定点突变（site-directed mutation） PCR，但是周期也不会短。克隆的片段不长的情况下，多挑几个去测序，里面肯定会有对的。尽量选用具有更高保真性的酶扩增。

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问利用加尾法 real-time PCR 方法检测 miRNA，PCR 上游引物设计有什么诀窍和原则吗？

phhcrab

1.不太明白你说的第一种方法，是直接miRNA反转录吗，cDNA跟miRNA一样长吗？因为miRNA片段非常小，PCR检测会比较困难。2.你说的第二个方法可能就是环状引物法，就是反转录的引物带有一个环状结构的，反转录后，环状结构会打开，就相当于是把原来的片段延长了，这样后续PCR就好做了，用SYBR Green或者探针检测都可以。现在这个方法用得很多，很多做miRNA检测服务的公司用的也是这种方

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问同一特异不同退火温度的 PCR ，如何确定最佳温度？

王二狗爱科研

温度越高则条带越暗，再高就没条带，我做过

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问PCR有产物但是电泳无结果是为什么？

alaling

1，marker和引物有条带，说明在跑胶的环节应该没什么问题 2.内参和目的条带均没有，说明很大可能是在跑PCR的环节出现问题，就是没有P出东西。应该在PCR的环节找问题 3.你说电泳无目的片段的条带，是指有其它非特异条带还是根本就没有条带？如果可以，放上图是最好的，大家都可以一目了然，比这里做排除法强的多

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