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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
请问模板的量大概应该控制在多少?
juyue2010
反转录后,取一部分cDNA稀释10倍,加2ul到pcr体系
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问
为什么细胞内DNA复制的引物是RNA?PCR的引物是DNA?
dxyc42u
我认为可能同RNA具有催化、遗传的双重性质有关
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问
PCR技术中加入的“引物”是什么?有什么作用?引物会在PCR仪中复制吗?
dxyc42u
引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补,并能引导模板DNA互补DNA链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体,其3'端必须具有游离的-OH.它按预先设计用化学方法合成,其长短与PCR过程的特异性高低密切相关.一般来说,引物长的,特异性高.
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问
哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR 实验使用?有何需要注意的地方?
dxyc42u
就买专门用来做pcr的管子即可,没啥特别要求,最后盖盖子带上薄膜手套盖
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问
PCR实验室出现污染怎么处理?
juyue2010
全面的紫外照射,过氧化氢消杀,还有核酸消除试剂处理
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问
PCR实验过程中易发生污染的原因有哪些?
dxyc42u
实验过程性枪头这些都要求无酶的,不要怕浪费枪头,严格执行无酶操作
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问
想请问小体系里,添加的酶体积比,还有体系里的终浓度有什么讲究吗?
dxyc42u
小体系的话一般多算几个孔最后做出来问题不大
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问
请问rct试验,可以用中药联合西药,对照另一个阳性西药
蓝莓小布丁
可以随机对照实验(rct)对不同组实施不同的药物干预以比较对照效果的不同。中西药联合用药是一种有效的治疗途径,可作为参考。
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问
感觉使用排枪加样会浪费很多样品或者试剂,大家是怎样解决这个问题的呢?
juyue2010
先配置比你总共需要的管数多2-3个样的mix,分装到8联排管管中,最后用排枪加。
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问
请问在加qPCR样的时候,反向吸排(先按到移液枪第二档再在加样时每次加到第一档)会更精确吗?有试过的小伙伴吗?
土井挞克树
会更加准确,反向吸排可以减少误差。
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问
溶解曲线出现杂峰的可能原因是什么?有哪些对应的解决办法?
dxyc42u
一般是出现引物二聚体,除此之外就要考虑及时更换试剂盒,
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问
在哪些情况下,PCR反应体系内的DNA浓度和纯度需要检测?
dxyc42u
一般做pcr都需要检测,这样才能保证要p的DNA质量,不然对结果影响大
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问
pcr快速核酸和普通核酸检测区别
huarenqiang5
常规 PCR 与快速检测的区别: 常规 PCR 检测在样本采集后需要进行核酸纯化再进行后续 PCR 反应,纯大概需要约 30 ~ 60 min。通常一块反应板中可够容纳 96 个独立的反应同时进行,(最多检测 91 个样本,外加 5 个质控样本),PCR 反应时间需要约 2 小时左右。而快速检测在样本采集后直接放入裂解液中释放核酸,通常无须进行核酸纯化可以直接进行 PCR 反应,使用快检
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问
请问退火温度如何选择?
huarenqiang5
55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
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问
在PCR技术操作中,是否需要能量,需向溶液中加ATP吗?
丁香52
不需要,能量来自外界加热PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成
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问
出现非特异性扩增带怎么办?
dxyc42u
1 提高退火温度;2 如果你的非特异袋较大,那么减少延伸时间,用15-20S试试;3 换引物,找到更特异的引物;
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问
怎样检测引物是否合成的好?
dxyc42u
一般按如下条件检测a溶解曲线单峰,窄而尖,否则可能有非特异性扩增;峰的位置横坐标一般在80度以上,这个温度为pcr产物的解链温度,如果在75度附近,可能是引物二聚体,mirna染料法检测时,溶解曲线的峰的位置可能在75度附件b琼脂糖电泳为明亮的一条带,条带一般在100bp以上,如果设计引物时pcr产物在100bp一下,需要仔细辨认是否为引物二聚体;引物二聚体的条带一般在50bp左右,条带弥散,暗。
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问
如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
土井挞克树
没有回收到目的片段可以用已知片段做对照。
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问
qPCR方法验证误差和偏差
Dr_劉医生
非特异性误差和偏差可通过保证实验前后一致性和重复实验次数来减少。
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问
组织以及血液miRNA的提取和扩增跟mRNA的有什么区别?
Dr_劉医生
最大的区别就是二者的表达是相反的,miRNA 的高表达水平导致 mRNA 的低表达水平
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