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        兄弟们谁能告诉我t7rna聚合酶为啥老纯化出来没有活性呢,醉了,纯化工艺需要哪里注意

        相关实验:T7RNA 聚合酶系统基因表达实验

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        冷锋FHV5

        兄弟们谁能告诉我t7rna聚合酶为啥老纯化出来没有活性呢,醉了,纯化工艺需要哪里注意

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        3 个回答

        user-title

        sswei

        有帮助

        1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

        2、不要太稀

        3、合适的pH,除非是进行聚焦层析,所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同,防止蛋白质的沉淀。

        4、使用蛋白酶抑制剂,防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,加入DNA酶,降解DNA,防止DNA对蛋白的污染。

        5、避免样品反复冻融和剧烈搅动,以防蛋白质的变性。

        6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

        7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇),防止蛋白质的氧化。

        8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂,防止重金属对目标蛋白的破坏。

        9、使用灭菌溶液,防止微生物生长。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        在纯化过程中,需要注意以下几点:

        选择合适的来源和纯化方法:T7 RNA聚合酶可通过原核表达或真核表达方式获得。在选择来源和纯化方法时,应根据实验需要和实验条件综合考虑。常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、尺寸排除层析等。

        避免过度稀释:在纯化过程中,应尽量避免过度稀释T7 RNA聚合酶,因为过度稀释可能导致酶活性降低。

        避免极端pH值:T7 RNA聚合酶的最适pH范围为7.5-8.5,过高或过低的pH值都可能导致酶的失活。

        避免高温和冷冻:T7 RNA聚合酶应保存在-20℃以下的冰箱中,避免高温和冷冻对酶活性的影响。

        注意缓冲液的成分和浓度:T7 RNA聚合酶的活性对缓冲液成分和浓度较为敏感,不同的实验条件需要采用不同的缓冲液配方和浓度。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        纯化过程中注意温度和ph保持稳定,不然酶容易变性

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