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        两种重组痘苗病毒共感染细胞

        相关实验:T7RNA 聚合酶系统基因表达实验

        最新修订时间:

        原理

        含有 pT7 控制的外源基因(「痘苗病毒系统基因表达实验」中「重组痘苗病毒(VTF7-3)感染后的脂质体转染」)的重组质粒,通过同源重组可整合到痘苗病毒中,并制备重组病毒储液。将此病毒储液与 vTF7-3 共同感染贴壁或悬浮细胞,在培养过程中,外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶转录,并在感染细胞的细胞质完成翻译。随后进行分析鉴定或纯化蛋白质。

        此共感染方案适用于大量生产蛋白质,基于这种目的,常使用悬浮培养的细胞(如 Vero 或 HeLa S3)。

        材料与仪器

        步骤

        1. 对于贴壁培养的单层细胞:


        1.1 感染 CV-1 贴壁单层细胞:在病毒感染前一天,用完全 MEM-10 培养基将 5 × 105 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养,直至细胞几乎汇片生长(一般过夜)。


        1.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶,涡旋混匀,温育 30 min,每隔 5~10 min 晃动一次。

        MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质表达。

        如果还有团状物,将其冷却到 0℃,冰上超声 30 s。可以重复几次超声,但超声的间隔中样品应当置冰上冷却(见「痘苗病毒系统基因表达实验」中「重组痘苗病毒(VTF7-3)感染后的脂质体转染」)。


        1.3 将两种胰酶消化的病毒储液混合。


        1.4 将胰酶处理后的病毒用 MEM-2.5 培养基稀释至 4 × 107 pfu/ml (每种病毒为 2 × 107 pfu/ml)。


        1.5 吸出培养基,用 0.5 ml 的病毒混合液感染 6 孔板中每孔的细胞,温育 1~2 h,每隔 15~30 min 晃动一次。


        1.6 加入 2 ml 的 DMEM-10 培养。根据使用的方法,在感染后 5~24 h 分析基因表达。如果纯化蛋白质,在感染 2~3 天后收获细胞。

        注:尽管在感染后数小时就可以检测基因表达,但一般在病毒感染的晚期进行免疫沉淀、免疫印迹或 Northern 印迹分析,因为这时 T7 控制的基因产物积聚到最高水平。早期分析一般检测表达蛋白的生物学活性。




        2. 对于悬浮培养的细胞:


        2.1 感染 HeLa S3 悬浮细胞:在病毒感染前,用血球计数器对细胞进行计数, 在室温下 1800 g 离心 5 min,弃上清。用转瓶 MEM-5 培养基重悬细胞至 2 × 107 细胞/ml,将其转移到较小的无菌组织培养瓶或 Erlenmeyer 瓶中。


        2.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶,涡旋混匀,温育 30 min, 每隔 5~10 min 晃动一次。

        MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质表达。

        如果还有团状物,将其冷却到 0℃, 冰上超声 30 s。可以重复几次超声,但超声的间隔中样品应当置冰上冷却(见「痘苗病毒系统基因表达实验」中「重组痘苗病毒(VTF7-3)感染后的脂质体转染」)。


        2.3 将两种胰酶消化的病毒储液混合。


        2.4 将胰酶消化病毒混合物加入浓缩细胞中,37℃ 悬浮培养。


        2.5 将感染后的细胞加入到大的旋转培养瓶中,用转瓶 MEM-5 培养基将其稀释至 5× 105 细胞/ml,37℃ 悬浮培养 1~3 天。


        2.6 收获细胞,分析或纯化表达蛋白(见步骤 1.6 注释)。


        注意事项

        1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养,除非有特殊说明。


        2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的,操作也必须无菌。

        来源:丁香实验

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