• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        核酸外切酶三介导克隆突然做不成功了

        相关实验:限制性内切酶消化 DNA 实验

        user-title

        andy219

        之前一直用的核酸外切酶iii做的不依赖连接酶方法克隆,阳性率挺高的,但是这个月一直做不成功,具体我的步骤如下:一. PCR扩增含目的基因及载体同源15bp片段

        二. PCR产物进行胶回收。

        三. 37℃酶切载体

        四. 载体双酶切产物行乙醇沉淀法纯化。

        五. ExonucleaseIII介导的DNA克隆

        1.50ng克隆片段

        25ng载体

        1ul exonucleaseIII Buffer

        双蒸水 补足总量为9ul

        混匀放置冰上5min。

        2.加入1ul exonuclease III(20U/L)吹吸混匀后继续冰浴60min。

        3.加入1ul 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)终止反应,用移液枪混匀后置于60℃水浴5min,再冰浴5min。

        4.取反应产物转化DH5α涂板。

        六.菌落PCR筛选

        七 . 双酶切鉴定

        现在问题是转化后一直不长菌,引物这些我都核对过了没问题,感受态也检查了没问题,请教有没有有经验的给点指导意见!

        wx-share
        分享

        4 个回答

        user-title

        MortYO9U

        有帮助

        请问您解决问题了吗?我目前也遇到了同样的问题,希望解答和交流,谢谢

        user-title

        灵枢天问

        有帮助

        用之前的阳性样本切一下。有可能是你的酶降解了

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        你的这个酶有没有问题,是不是时间长了,失效了,如果你别的东西都没有问题的话

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        你是不是换酶的问题,之前的酶比较高效

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序