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        CRISPR CAS9质粒 T7E1 sanger sequencing TAcloning

        相关实验:全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验

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        葡萄提子529

        各位大佬们,小弟第一次做CRISPR敲除实验

        现在就是请公司帮忙构建了三个质粒,不同的sgRNA序列。现在想验证这三个质粒中,敲除效果最好的一个,也可能没效需要重新构建。

        有个疑惑,我打算用lipo来筛选有效的质粒,打算转染mcf-7。

        看到文献一般做T7E1酶切实验,sanger sequencing,TA cloning来验证,但是我的质粒没有带嘌呤抗性,倒是有egfp表达基因。后面没办法做药筛,实验室没有设备支持挑选单克隆。请问如果就是转染效率不高,T7E1切得出来吗,直接转染后不筛选,不挑单克隆,然后提取基因组DNA,回收pcr产物,sanger sequencing 和TA Cloning能出想要的结果吗,是不是sanger sequencing出来的肯定是套峰。

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        2 个回答

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        你可以直接梯度稀释,铺96孔板,挑单克隆。然后得到目的细胞。 只要有knock out T7E1 就能切出条带。你这么混着,送测序,绝对是套峰

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        要不你试一下,我感觉很大概率会是套峰,我建议可以外送实验。

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