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请问做circRNA的大佬 大家PCR的时候 有p出来好多条条带嘛
Eason老歌迷
出了不少杂带了呗?有很多原因,可能是引物的特异性不高。也可能是酶的用量偏高或酶的质量不好。可能是 Mg2+浓度偏高。或者是 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。也可能是外源DNA污染。
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DNA纯化
秋秋欣欣
A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min,丢去上清夜,收集菌体。B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积
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质粒稀释后细胞上样浓度是160Nm,想计算100ml稀释液中需要多少ug干粉?
Eason老歌迷
ug/L和ng/ml其实可等量换算,因为1微克=1000纳克,1升=1000毫升。如果现在的标准单位nmol/L换算成原来的老单位ug/L,应除以3.12,即nmol/L/3.12 =ug/L
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求助LC/MS检测circRNA翻译产物的问题
天一湖医者
质谱测序不能cover你所有的序列,也就是说你通过它能知道你基因的reading frame没错,但不知道这个蛋白的开始和结尾在哪个点上。我觉得最好的办法用质谱测你完整蛋白的分子量,如果和你的理论值一样,那就是蛋白在胶上的电泳行为的问题,
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紧急求助大佬
Eason老歌迷
按照你的思路,自杀质粒应该携带目的片段降解了,但是事实是没有降解,那就说明这个降解通路收到抑制或者是压根就是没转染上。
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上游引物连微球
天一湖医者
这个要看引物长度较短,一般会降低扩增特异性,但会提高有效性,扩增的产物种。
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包涵体的溶解液,只用脲就可以了吗?有没有更具体的配方?
Eason老歌迷
可以直接用8M的脲或 6M胍融解,取上清,测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。
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问
重组质粒双酶切后看不到目的片段,上面那个载体一万多bp,底下这个载体5000多bp,怎么回事?
Eason老歌迷
连接产物酶切后跑胶没见目的片段可能是目的片段量比较少,没有电泳检测不出,挑菌提质粒后有没有目的片段可以用PCR检测一下。
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请问大家,这个质粒图谱的平行箭头表示什么?为什么会有两个平行箭头?为什么箭头有反向?
Eason老歌迷
质粒上有多个基因,基因的方向不一样,所以就有不一样的箭头方向。如果一个图谱上有两个方向,可能是有两个启动子。
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Southern Blot
Eason老歌迷
背景有点高啊。你可以降低探针的浓度。或者延长封闭时间。或者提高洗膜温度,增加表面活性剂,降低盐浓度。或者用高质量的滤纸接触膜试一试
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怎么收集细胞上清进行酪蛋白ELISA检测?直接保留上清还是收集细胞后离心保留上清?
balalaLy
直接收集不同时间点的细胞上清,离心去除杂质
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关于突变信号肽序列研究的相关问题
Eason老歌迷
肯定是不能的。信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15~30个氨基酸组成。包括三个区:一个带正电的N末端,称为碱性氨基末端。一个中间疏水序列.以中性氨基酸为主,能够形成一段d螺旋结构,它是信号肽的主要功能区。一个较长的带负电荷的C末端,含小分子氨基酸,是信号序列切割位点.也称加工区。一般使用定点突变。
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EMSA求教!!!
天一湖医者
EMSA实验需要设置许多组对照实验。EMSA非放射性探针设计要注意:(1)防止错位配对、封闭成环,排除目标序列以外结合位点的(2)防止产生空间位阻(3)注意AT/GC比例(4)EMSA探针不宜太长,一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难,还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。(5)建议采用Biotin或红外荧光标记,尽量不要采用DIG标记。,探针两端都有标记以提高灵敏度
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Southern Blot
天一湖医者
Southern杂交实验中,基因组酶切后跑电泳用的胶需为9.8cm×8.0cm 大小
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质粒构建
Eason老歌迷
既然已经换引物了,说明不是引物的事,还是质粒啊,有没有一种可能,发生了自连?
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紧急求助
天一湖医者
基因和自杀质粒连接不上,一般是因为限制酶的识别位点大多是反向对称的,如果只用用同种酶切,所得片段的2端序列相同,在连接时,是随机连接,不仅会出现反向连接,而且会出现片段串联。
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细胞技术与形态学板块
balalaLy
伊红很容易染,也很便宜,很可能是你用的伊红有问题,直接换吧
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有没有能够在细胞内产生环状RNA的质粒?
Eason老歌迷
并没有发现。环状RNA由特殊的选择性剪切产生,大量存在于真核细胞的细胞质中,具有一定的组织、时序和疾病特异性。
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问
lamp2b的CDS哪里找 NCBI没有
迟C迟
文章的补充材料一般会提供基因序列,实在没有,可以联系作者提供。
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问
寻找某基因-170到90序列时第一bp是CDS区起始密码atg中的A么?
bamboopiggy
启动子(promoter):与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。转录起始点(TSS):转录时,mRNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基,通常为一个嘌呤。
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