Lineweaver-Burk 双倒数法判断出对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，具体步骤怎么做

双倒数曲线可以判断抑制剂类型：

通过酶抑制作用的动力学研究，计算无抑制剂和有抑制剂时的Km与Vmax，当Vmax值不变，而Km变大时，该抑制剂属于竞争性抑制剂；当Vmax变小，Km不变时，该抑制剂属于非竞争性抑制剂；当Vmax值减小，Km变小时，该抑制剂属于反竞争性抑制剂。

葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

1反应溶液的制备

(1）配制底物 PNPG 溶液：精确称0.3766gPNPG，加适量0.1mol/ L 磷酸缓冲液( pH 为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/ L 的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。

(2）配制 a ﹣葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/ mg ）用0.01mol/ L 磷酸缓冲液（ pH 为6.8）溶解，配制成2u/ mL 的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/ mL 的酶溶液，备用。

(3）配制 DNJ 标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μ g / mL DNJ 标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60ug/ mL 六个不同梯度的标准品溶液，备用。

(6)0.2mol/ L 的Na2CO3：称取2.16gNa2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL,4℃下保存，备用。

2 PNP 标准曲线的绘制

精确称取0.0278g对硝基酚（ PNP )，加0.01mol/ L 磷酸缓冲液（ pH 为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/ L 母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μ mol / L 的标准溶液。取100pul上述标准液，各加入150uL0.2mol/ L 的Na2CO3，混匀1 min ，再于405 nm 处测定其吸光度，得标准曲线方程：y =128.13x+0.3579(R2=0.9998)，其中 y 为浓度， x 为吸光值。

3a﹣葡萄糖苷酶抑制活性的测定

测定方法参照 Masao Hattori 等试验条件，并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。按表依次加入 PBS 缓冲液、抑制剂溶液和底物，混合均匀，于37℃水浴保温10min，结束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混匀，于37℃水浴反应20min，结束后加入150uL0.2mol/ L 的Na2CO3溶液中止反应。由于 PNPG 在 a ﹣葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和 PNP , PNP 在405nm处有最大吸收，其测定其吸光度，根据公式便可计算出各样品 a ﹣葡萄糖苷酶的抑制率及 ICso 值。

使用Lineweaver-Burk双倒数法（Lineweaver-Burk plot）可以帮助确定对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，常见的抑制类型包括竞争性抑制、非竞争性抑制和混合型抑制。以下是使用Lineweaver-Burk双倒数法进行抑制类型判断的具体步骤：

1. 准备实验样品：准备一定浓度范围内的底物（α-葡萄糖）和不同浓度的抑制剂（例如，抑制剂A、B、C等）。确保所有试剂的浓度和制备方式准确无误。

2. 进行酶反应：在一系列试管中，分别加入相同量的α-葡萄糖苷酶和不同浓度的抑制剂。在每个试管中加入相同体积的底物溶液，并在适当的条件下进行酶反应（通常在特定温度和pH下进行）。

3. 终止反应：在一定时间后，使用适当的方法终止反应，例如加入酸性溶液或进行加热。

4. 测定反应速率：根据实验设计选择适当的方法测定反应速率。可以使用各种方法，如比色法、荧光法或放射性测量等。

5. 绘制Lineweaver-Burk图：将测得的反应速率数据转换成双倒数形式，即1/反应速率（1/V）作为纵坐标，1/底物浓度（1/[S]）作为横坐标。在图上绘制出每个试管的数据点。

6. 分析图形：根据所观察到的Lineweaver-Burk图形状，判断对α-葡萄糖苷酶的抑制类型：

- 竞争性抑制：竞争性抑制会导致Lineweaver-Burk图中数据点在纵坐标上相交。竞争性抑制剂会增加底物的亲和力，使得酶底物复合物的形成受到抑制，但最大反应速率不受影响。

- 非竞争性抑制：非竞争性抑制会导致Lineweaver-Burk图中数据点在横坐标上相交。非竞争性抑制剂与酶底物复合物或游离酶反应，减少最大反应速率。

- 混合型抑制：混合型抑制会导致Lineweaver-Burk图中数据点在纵坐标和横坐标上相交。混合型抑制剂同时影响底物的亲和力和最大反应速率。

需要注意的是，Lineweaver-Burk双倒数法是一种近似方法，结果可能受到实验误差的影响。因此，在进行抑制类型的判断时，建议结合其他实验数据和分析方法进行综合评估和确认。