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请问PCR在组织样中扩增出来条带出现了一千多的,但目的条带在两百左右,而且在细胞样中扩增没有出现一千的条带,可能是什么原因呢?

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dxy_nntfa8i

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2 个回答

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PCR反应扩增产物出现多条带原因:

(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。

(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。

(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

(5)样品处理不当。

(6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。

(7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。

(8)复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

(9)反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

(10)引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(11)引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

(12)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

(13)外源DNA污染。确保操作的洁净。

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土井挞克树

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那还啥考虑有污染,有其他核酸污染

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